干货 | 酶切实验切开 or 切不开，真的是玄学吗？
转自：诺唯赞生物
DNA限制性内切酶酶切是一项基于DNA限制性内切酶的基因工程技术，限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。
分子克隆是玄学，酶切成功靠运气？
今天我们就来分享一下酶切经验和绝招，解决切不开、错切难题，get实验成功关键点，打破酶切玄学！
Part1酶切不完全的原因及优化方案
- 限制性内切酶活性下降 -
✫用5-10倍酶量过量消化。
- 模板DNA -
1.模板DNA不纯
✫模板制备过程中使用到乙醇、氯仿、苯酚、SDS、EDTA等，残留在DNA模板中，会不同程度影响酶的活性，可将DNA过柱纯化。✫PCR中参与扩增反应的DNA聚合酶具有外切酶活性，可能会影响酶切产物末端完整性，进而影响克隆效率，建议使用PCR纯化后的产物。
2.内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰
✫甲基化的DNA可耐受部分限制性内切酶的切割，如果酶对甲基化敏感，还需要选择对甲基化不敏感的酶。
3.酶切位点数量
✫模板DNA上酶切位点的数量决定酶的用量，酶切位点数目多的模板切割效率低于酶切位点少的模板，针对酶切位点多的模板DNA，可以增加酶的用量。✫基因组DNA使用的酶切体积一般高于PCR产物以及质粒DNA。
4.限制性酶切位点
✫酶的识别位点过于接近终端（线性DNA）以及切割位点相邻（双酶切）都可能影响酶切效率。切割位点相邻的双/多酶切需注意酶切顺序，先酶切识别序列两端需要有多个碱基的位点，再酶切其他位点。
5.DNA结构
✫超螺旋DNA完全酶切比线性DNA所需要的酶量高，同时需要提高酶的用量和延长反应时间。
-操作-
1.部分DNA溶液粘在管壁上
✫反应前务必使反应液彻底离心至管底。
2.内切酶溶液粘度大，取样不准
✫配制完其他组分后，最后再加入酶。
-反应条件不合适-
✫双/多酶切需选择各种限制酶均可发挥活性的酶切缓冲液。若使用传统限制酶，双/多酶切的条件不同，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。诺唯赞SwiftCut快速限制性内切酶采用通用Buffer，单/双/多酶切均可使用同一管Buffer，告别多管缓冲液、操作简便。
Part2DNA完全未被酶切的原因及优化方案
-限制性内切酶失活-
✫标准底物检测酶活性。
-反应条件不合适-
✫检查各组分添加量、反应温度、反应时间是否为最佳。
-反应条件不合适-
1.模板DNA不纯✫模板DNA中含有SDS、酚、EDTA等酶切抑制因子，可将DNA过柱纯化。2.内切酶对甲基化敏感，底物DNA酶切位点上的碱基被甲基化✫甲基化的DNA可耐受部分限制性内切酶的切割，如果酶对甲基化敏感，还需要选择对甲基化不敏感的酶。3.DNA酶切位点上没有甲基化（使用DpnⅠ）✫重新将质粒转至dcm+和dam+甲基化菌株中扩增。4. DNA不存在该酶识别顺序✫过量酶消化进行验证并换用其它酶切割DNA。
Part3错切，切开的条带数量、大小不对 的原因及优化方案
-组分污染-
✫模板DNA、酶、反应所用组分被其它限制性内切酶、DNA和核酸酶污染。
-模板DNA突变-
✫底物DNA在扩增过程中引入了突变，突变可能破坏已知的识别位点或创造出新的酶切识别位点，从而产生错切条带。可对模板DNA测序判断是否突变。
-酶与模板DNA结合-
✫部分限制性内切酶（如FokⅠ，TauⅠ）可能会与DNA结合，导致电泳时出现明显的凝胶迁移，使用含SDS的上样染料，加热使酶从切割的DNA上解离开。
看完以上问题分析和经验分享，大家是不是对“玄学实验”多了一些信心呢？
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