顶刊鉴析 | 探索HBV RNA在不同条件下的稳定性差异
转自：仁度生物
在生物课本中，有一个重点知识，老师总会特别强调，
“RNA是单链，不稳定，容易降解”。
但RNA凭借灵敏度高、特异性好等特点在病原体检测中愈加普及，因此大家越来越关注RNA的保存条件以及在不同样本中的稳定性差异，目前已经批准上市的HBVRNA检测试剂盒中标注的保存条件为-20℃3个月，-80℃长期。最近有研究显示，HBVRNA能够在采血之后的48小时内，于4℃或者25℃稳定保存，-20℃及-80℃保存的样本可反复冻融4次。
方法
收集来自40名HBVDNA复制依然活跃的慢性乙型肝炎感染患者的血液，在2小时内收集和处理。每个患者的血浆被分开并储存在4°C和25°C（室温）以及六种不同的储存时间（0、2、6、12、24和48小时），随后转移至-80°C储存。使用10个患者的血浆对-20°C~25°C或-80°C~25°C多次冷冻循环的效果进行评估，同时使用数字聚合酶链反应(dPCR)方法对样品中pgRNA进行定量。有关pgRNA的差异，比较基线和每个时间点的水平方程(GEE)。定义pgRNA的变化大于0.5log10拷贝/mL被视为具有临床意义。
结果
最初收集的血浆样本中的平均HBVpgRNA水平为5.58log10拷贝/mL（范围从3.08到8.04log10拷贝/mL）。平均pgRNA水平与初始参考样本浓度相比，在不同时间段存储的样本与基线相比，均存在不同程度的减少。储存6、12、24和48小时的pgRNA水平分别减少−0.05log10拷贝/mL（95%置信区间(CI)−0.095至−0.005，p=0.03)；−0.075log10拷贝/mL(95%CI[−0.12至−0.03],p=0.001)；−0.084log10拷贝/mL（95%CI[−0.13至−0.039]，p<0.001）以及−0.120log10拷贝/mL（95%CI[−0.17至−0.076]，p<0.001）(图1)。但是，这些改变均小于0.5log10拷贝/mL，在定量允许范围内。相比保存在4°C或者25°C，样品中pgRNA水平也没有显著的差异变化（−0.01log10拷贝/mL；95%CI[−0.708~0.689]，p=0.98）(图2)。
注释：HBVpgRNA的平均值（+/-1SE）储存在4°C或25°C的血浆中的水平。在2、6、12、24和48小时测量HBVpgRNA载量，以log10拷贝/mL表示。圆圈表示4°C存储，方块表示25°C存储。
注释：HBVpgRNA的平均值（+/-1SE）储存在4或25°C的血浆中的水平。在2、6、12、24和48小时测量HBVpgRNA载量，以log10拷贝/mL表示。三角形表示4°C存储，圆圈表示25°C存储。
接着，研究对-20°C和-80°C的温度条件下进行四次冻融循环。结果显示，无论是-20°C~25℃还是-80°C~25℃的反复冻融，均不会影响HBVRNA在样本中的稳定性（图3）。
注释：均值(+/-1SE)的HBVpgRNA水平，表示为log10拷贝/mL，测量多达四次冻融周期。三角形和圆圈分别表示在-80°C和-20°C下的储存。
结论
因此，血浆HBVpgRNA水平在4°C和室温下稳定至少48小时和多次冻融循环。结果表明pgRNA在采血过程中是稳定的，因此pgRNA的定量结果是可以信任的。
如此看来，HBVRNA实际上比我们比想象中的更加稳定，这是因为存在于血清中的HBVRNA是有蛋白质外壳包裹的，因此能够在室温保存一段时间（图4）。
不仅仅是HBVRNA，更多的研究还揭示了其他种类的RNA在不同保存条件下的差异，例如HCVRNA，有研究证实其可以在4℃的条件下最长保存168h（7天），与基线数据相比，7天后的浓度变化仅为0.467log10拷贝/mL（5.025vs.5.492），但是如果进行5次从-80℃到25℃的反复冻融，样本浓度出现显著差异（4.454vs.5.492），结合前面的数据。提示反复冻融4次可能是极限。另外还有研究提示，在设置的6个不同温度条件下，
1）25℃，5天
2）4℃，5天
3）-20℃，5天
4）-80℃，5天
5）4℃，6个月
6）-80℃，6个月
样本不能在室温下放置5天（1），不能在4℃放置6个月（5），其余4个温度条件均可，结合前面的数据推测，RNA在室温存放的极限可能为3-4天。
总而言之，通过以上种种数据，表明RNA比我们想象中更加稳定，而更多的一些个性化的保存条件还有待进一步的考察验证。
参考文献：
1.Rattanachaisit,Pakkaponetal,‘StabilityofHepatitisBVirusPregenomicRNAinPlasmaSpecimensUnderVariousTemperaturesandStorageConditions’(2021)9PeerJ(SanFrancisco,CA)e11207
2.Halfon,Philippeetal,‘ImpactofVariousHandlingandStorageConditionsonQuantitativeDetectionofHepatitisCVirusRNA’(1996)25(3)Journalofhepatology307
3.Gessoni,Getal,‘TheStabilityofHepatitisCVirusRNAafterStorageat+4DegreesC’(2000)7(4)Journalofviralhepatitis283