分离三要素的解读
转自：药事纵横
摘要
本文通过解读分离度Rs与塔板数N，保留因子K，选择性α之间的关系，为广大读者在方法分离过程中采取的改进策略提供理论依据，便于后期方法优化的开展。
色谱理论中，分离度Rs公式有多种表达形式，然而笔者认为，包含塔板数N，保留因子K，选择性α的表达式最具实践指导意义。
图1分离度Rs表达公式
如图1所示，此公式清晰体现了分离度Rs与塔板数N，保留因子K及选择性α之间的数学关系。如何利用此公式指导具体的方开发，达到理想的分离效果呢？笔者对此进行简单解读。
塔板数N的应用
图2：分离度Rs与塔板数N之间的关系
分离度Rs与塔板数N之间的关系如图2所示。由图可知，分离度Rs与塔板数N在一定区域内近似接近线性关系，随着塔板数N的增加，分离度Rs会一直增加。正是源于此关系，所以寻找高效的色谱柱成为广大色谱工作者改善分离的常用手段。
如何挑选高效的色谱柱，我们首先要了解如何估算色谱柱的柱效。
色谱柱柱效估算公式如下所示：
N≈500L/dp
L—色谱柱长度（mm），dp—颗粒直径(um)
由上述公式可知，柱效N与柱长L成正比，与粒径dp成反比。因此，只要我们在原来色谱柱基础上增加柱长、减小粒径或者同时采取这两方面的措施，均能做到增加柱效。至于增加的比例，则由上述公式可计算。另外，上述公式简化为L/dp后则可用于以比较两根色谱柱是否等效。例如两款色谱柱，分别为4.6*150mm,3um和4.6*250mm,5um，由公式L/dp可推知，两者L/dp=50，因此两款色谱柱可视为等效。目前市面上除了常规全多孔外颗粒色谱柱外，核壳颗粒色谱柱也越来越受到重视，其中一方面就是其出色的柱效。与传统全多孔颗粒色谱柱比较，其柱效往往提高20%以上。
根据图1分所揭示的数学关系，我们可利用此公式预判改变柱效N后获得的分离度Rs。例如，某物质在4.6*250mm,5um的色谱柱上的分离度为1.0，尝试更换为同款4.6*250mm,3um的色谱柱。由公式推算可知，更换后其达到的分离度约为1.3。因此，利用此公式通过对分离度的预判，可避免不必要的试验。
保留因子K的应用
图3分离度Rs与保留因子K之间的关系
分离度Rs与保留因子K之间的关系如图3所示。在讨论分离度Rs与保留因子K之间的关系前，笔者先介绍一下保留因子K的计算公式，如下所示：
K=（tR-t0）/t0,
t0—死时间，tR—溶质保留时间
由图3可知，当保留因子K≤5时，通过改变K值，分离度都能得到极大的改善。当保留因子K≥10，通过改变K值，分离度得到的改善却极小。因此，方法开发过程中，如果色谱峰的保留因子K≤5，此时通过改变K值便能有效的改善分离。如果色谱峰的保留因子K≥10，此时通过改变保留因子K将会收效甚微。因此当保留因子K≥10时，改变其他参数将会更加有效。
如图4案例所示，当K=10时，二者的分离度为2.07；当K=20时，二者的分离度仅为2.16。虽然二者分离度略有增加，但此时付出的代价却是检测时间的加倍。因此，当K≥10时，利用K值改善分离度并不是一种明智的举措。
图4分离案例：K=10（上图）与K=20（下图）分离图谱
选择性α的应用
图5分离度Rs与选择性α之间的关系
α=k2/k1
k1—色谱峰1的保留因子，k2—相邻色谱峰2的保留因子
由图可知，当选择性1≤α≤2时，通过改变α值，分离度都能得到极大的改善。当选择性α≥6时，通过改变α值，分离度Rs得到的改善相对变小。比较图2、图3及图5纵坐标分离度Rs数值可知，影响分离的三要素中，选择性α对分离的影响是最大的。即使选择性α的微小改变，也能带来分离度Rs的巨大改变。所以，选择性α是改善分离度Rs的最有效方法。
实际工作中，对于选择性α我们所用到的区域一般都是1≤α≤2的区域。为什么应用仅仅在此区域内呢？笔者用以下案例为大家解读。色谱分离中，一般保证溶质的K介于1≤K≤10区间内。假设某物质分离条件为4.6*250mm,5um的色谱柱，流速为1.0ml/min，此时t0≈2.5min。当某物质保留因子K1=1，若α=2，则相邻物质K2=2，此时两物质的保留时间分别为t1≈5.0min,t2≈7.5min,这种情况下，二者已经完全分离。因此选择性α＞2时，分离度Rs已经满足要求，不必再改善分离。所以，选择性α在1≤α≤2的区域才有改善的必要。
分离条件对三要素的影响
以上部分，我们对分离度Rs与塔板数N，保留因子K，选择性α之间的关系进行了论述。那么方法开发过程中，如何改善这三要素呢？通过图6我们可以找到具体的控制措施。
图6分离条件对塔板数N，保留因子K，选择性α的影响
++—主要影响，+—次要影响，-—相对影响较小，0—没有影响，a— 对于可电离的溶质分子来说。
由图6可知，塔板数N受影响条件较多，其中色谱柱长度和颗粒大小是影响塔板数N的主要条件，其具体计算公式前文也已经有论述，其他条件对塔板数N的影响相对较小。保留因子K主要影响因素包括有机相比例B%，流动相pH以及离子对试剂浓度。对于不可电离的物质而言，流动相pH以及离子对试剂浓度对保留因子K就不再是主要影响因素。选择性α的主要影响因素为溶剂种类、色谱柱类型、流动相pH以及离子对试剂浓度，其他条件影响相对略小。当然有些分离条件对三要素的影响并不是孤立的，比如流动相pH，在改变保留因子K的同时也改变了选择性α。因此，当我们明白分离条件对塔板数N，保留因子K，选择性α的影响大小之后，后期开展工作才会有的放矢，更加高效。
以上便是笔者对分离度Rs与塔板数N，保留因子K，选择性α之间的关系进行的解读，鉴于笔者能力有限，若有不当之处，敬请各位读者指正。
参考文献：
1.《现代液相色谱技术导论》
2.《HPLCteachingassistantEnglishv1.3》
3.《实用高效液相色谱法的建立》
4.《CounttheCost,PartI:IncreasingResolutionbyIncreasingColumnEfficiency》
5.《CounttheCost,PartII:IncreasingResolutionbyIncreasingRetention》
6.《CounttheCost,PartIII:IncreasingResolutionbyChangingSelectivity》