前沿 | 刘如谦团队揭示体内编辑疗法新进展！《自然-医学》：有望预防致命心脏病
转自：药明康德
肥厚型心肌病（HCM）是一种原发性心脏疾病，通常起因于心肌蛋白编码基因发生突变，以异常的心肌增厚为特征，并伴有左心室腔缩小和心肌纤维化。HCM大多发生在年轻成人群体中，并且可能进一步发展为心力衰竭、心律失常甚至心源性猝死，患者拥有的治疗选择十分有限，包括抗心律失常药物，植入式除颤器和心脏移植。
对于HCM这类由于基因突变所导致的疾病，体内基因编辑为这些患者带来了新的希望，这种创新治疗方式在包括转甲状腺素蛋白淀粉样变性、癌症、血液病等多种疾病中已开始大显身手，现在，HCM患者也有望从中获益。
近日，《自然-医学》期刊发表了一项基于精准碱基编辑技术的临床前研究，以期在症状发生前纠正导致HCM的致病基因变异，实现“一次治疗，永久治愈”的长远目标。这项研究由碱基编辑领域先锋刘如谦博士和哈佛医学院的合作团队共同完成。
在这项研究中，研究人员构建了可模拟人类肌球蛋白R403Q突变的小鼠模型，其病理特征和人类疾病表现类似，包括左心室肥大、心室腔缩小以及心肌纤维化。基于该动物模型，他们评估了两种不同的基因疗法策略在防止HCM小鼠发生心脏病变方面的表现——即：利用碱基编辑器ABE8e对致病基因进行编辑，或是使用基于AAV9的Cas9/gRNA系统让致病基因彻底沉默。
研究人员使用的基因编辑工具为基于AAV9双载体递送的ABE8e碱基编辑器。在实际操作中，需要共同转导2个AAV9载体，每个载体表达一半的碱基编辑器，并在细胞内以反式拼接的方式重组为全长碱基编辑器。研究人员分别对2种小鼠品系进行了体内碱基编辑，两种小鼠均带有肌球蛋白R403Q突变，其中一种小鼠在20-25周龄时出现左心室肥厚，以模拟人类HCM患者隐性病变（下文称之为“隐病”小鼠），另一种小鼠在8-10周龄时迅速发病出现左心室肥厚症状，以模拟人类暴发性HCM（下文称之为“暴病”小鼠）。
单次基因编辑治疗“隐病”小鼠
“隐病”小鼠在出生10-13天时，研究人员通过胸腔注射的方法将单剂碱基编辑器注射到小鼠体内。经检验，“隐病”小鼠心室组织内70%的致病基因转录本得到了纠错修复，并且编辑的精度非常高，在心外组织外的发生的靶向编辑水平极低，而且几乎没有旁观者编辑（bystanderediting）现象。由于给药方式为胸腔内注射，研究人员观察了胸腔内其他组织器官（如肺），以及肝脏的潜在受损情况，发现肺和肝脏细胞结构均保持正常，并且炎症细胞没有富集，肝脏的血清学指标也都正常，为这种疗法的安全性提供了佐证。
连续超声心动图（14-32周）显示，经过基因编辑治疗后，隐病小鼠模型的左心室后壁厚度、心室重构状况没有出现病变，与野生型小鼠相比没有区别。这些发现表明，在小鼠出现疾病表型的典型时间点之前的几个月或几个星期，对携带R403Q突变的等位基因进行碱基编辑，就能持久地防止心室重构和肥大。
碱基编辑治疗也显著改善了HCM小鼠的心肌纤维化状况，通过对比接受/未接受基因编辑治疗和野生型小鼠的心室切片，研究人员观察到治疗后“隐病”小鼠的心肌纤维化程度极低，与野生型小鼠的心肌纤维化程度相似，并明显低于未经治疗的“隐病”小鼠。
双剂量基因编辑治疗“暴病”小鼠
从隐病小鼠的治疗中，研究人员发现，基因编辑效率在不同的小鼠中不尽相同，并且在不同心脏结构组织中的效率也不一致，比如右心室和心房组织中的编辑效率低于在左心室中的编辑效率，在HCM中，这些心脏组织都会发生病理重构。因此，在“暴病”小鼠模型中，研究人员尝试用2剂基因编辑的方法，观察是否能改善这些心脏部位的编辑效率，并预防病变发生。小鼠在出生第14天内接受了第一次基因编辑，并在之后的一周内接受第二次注射。
结果表明，双剂量基因编辑方案显著改善了HCM“暴病”型小鼠的心脏功能。连续的超声心动图显示，与未经治疗的小鼠相比，双剂量治疗的小鼠没有出现左心室肥大、心室重塑或收缩力过强的情况，心肌纤维化程度明显减轻（P=0.05）。此外，肝脏酶的血清学评估均正常，表明了这种双剂量治疗方案没有对肝脏造成损伤。但意外的是，与单剂量基因编辑相比，额外的剂量并没有明显增加左心室和右心室的平均编辑效率，而心房的编辑效率在两剂后比一剂时有所提高。此外，双剂量基因编辑治疗的旁观者编辑的现象显著高于单剂量治疗。
基因编辑治疗的出色“纠错”能力
研究人员用RNA测序的方法分析了小鼠左心室组织的基因转录情况，发现治疗后的“暴病”型小鼠的RNA转录产物和野生型小鼠有更大的相似性，而未经治疗的小鼠则不然。此外，经过治疗的小鼠模型心脏细胞中，参与心肌肥厚性重构过程的基因水平普遍有所改善，并且与纤维化相关的基因表达水平相比于未治疗的小鼠显著降低。这些发现提示，基因编辑治疗修复了因致病基因突变所导致的基因表达异常，使得心肌正常功能和形态得以维持。
让致病基因永远“沉默”下去
除了对基因突变进行序列纠错，研究人员同时也探讨了让突变型等位基因永久失活的治疗效果。这一策略可以克服设计碱基编辑器的需要，通过编辑常见的、良性的多态性来产生等位基因特异性的移码突变失活，从而让每个致病变体实现功能性敲除。此外，人类基因组数据表明，单个肌球蛋白等位基因的功能变异是可以容忍的，保持正常肌球蛋白基因剂量的一半似乎就足以满足小鼠和人类的正常心脏功能的需求。因此，研究人员打算让携带HCM致病基因突变的那条等位基因永远地“沉默”下去，不再表达致病肌球蛋白。
研究人员选择使用金黄色葡萄球菌的Cas9酶来完成这一任务，他们将Cas9和sgRNA包裹进AAV9载体中并输入小鼠体内，通过引入双链DNA断裂来选择性地让某条等位基因失活。
功能测试表明，有效的基因沉默可以修复心肌肥大表型，但是在较高剂量下，尽管治疗防止了左心室肥厚的发生，但心肌的收缩功能也会降低，甚至出现心力衰竭。后续研究发现，Cas9酶处理对于未突变的野生型等位基因也有破坏作用，这或许是造成上述小鼠心肌收缩功能不足的问题所在。相比之下，用中、低剂量处理的小鼠存活了下来，并具有与野生型小鼠相似的活力，各小鼠的平均心肌收缩力和平均心室尺寸也没有显著差异。所有接受中剂量治疗的小鼠的左心室壁厚度仍然正常，然而有一只接受低剂量治疗的小鼠出现了左心室肥厚和左心室容积减少。
根据这些数据，研究人员认为，低剂量的Cas9核酸酶不足以使小鼠的突变等位基因持续失活。而高剂量的Cas9核酸酶尽管能纠正心脏病变，但会导致收缩力减弱。中等剂量似乎是一个合适的剂量值，可以持续地纠正心室肥大，并且不会导致心脏功能紊乱。
结语
综上所述，本研究利用HCM小鼠模型探究了碱基编辑法和Cas9/gRNA的体内编辑应用场景，并确定了这些疗法的治疗窗口、风险和潜在益处：利用碱基编辑法纠正≥70%的心室心肌细胞中的致病基因变体，足以保持持久、正常的心脏结构和功能；而双倍剂量的编辑虽然提升了心房处的编辑效率，但也增加了旁观者编辑现象的发生。RNA引导的Cas9核酸酶有效地灭活了致病等位基因，但由于剂量依赖性的毒性，需要一个狭窄的治疗窗口来维持健康。
这些临床前研究表明，单剂量基因编辑疗法在纠正或沉默致病基因变体、预防HCM疾病发生方面具有相当大的潜力。
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参考资料：
[1]Reichart,D.,Newby,G.A.,Wakimoto,H.etal.Efficientinvivogenomeeditingpreventshypertrophiccardiomyopathyinmice.NatMed(2023).https://doi.org/10.1038/s41591-022-02190-7
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