ACS Catalysis | 上海交大微生物代谢国家重点实验室团队揭示膜锚定P450高效催化合成灵芝酸的机制
转自：生物谷
近日，上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室肖晗副研究员与石婷研究员、钟建江教授合作，首次揭示膜锚定细胞色素P450高效催化合成灵芝酸的机制，相关成果“Rationalengineeringofamembrane-anchoredpromiscuouscytochromeP450forefficientbiosynthesisofvaluableganodericacids”发表在催化领域高水平期刊ACSCatalysis。上海交大博士生罗裕欢、杜泽乾、硕士生蒋陈健为共同第一作者，本科生于子骞为共同作者，肖晗副研究员、石婷研究员、钟建江教授为共同通讯作者。
催化活力和底物选择性的机制
II型灵芝酸是药用高等真菌灵芝在菌丝体发育阶段合成的三萜化合物，具有显著的生物活性，包括抗癌、抗转移、抗高血压等。它们的高效生物合成对于揭示中药的物质基础，加速新药研发具有重要意义。然而，由于II型灵芝酸合成受到复杂调控机制以及灵芝尚不成熟的遗传操作，其高效的生物合成仍然极具挑战。肖晗副研究员及其合作者在前期工作中鉴定了一个具有底物杂泛性的膜锚定细胞色素P450CYP512W2，对合成II型灵芝酸关键代谢节点的GA-Y和GA-Jb至关重要（图2）（NatCommun,2022,13:7740）。
合成II型灵芝酸GA-Y和GA-Jb的反应路线
本项工作首先基于密度泛函理论研究了CYP512W2的最适反应顺序。推测在C7氧化完成后，CYP512W2能够通过两种可能的反应途径进一步将C7羟基化的HLDOA转化为GA-Jb。一种是先发生C15-羟基化，然后由水合质子介导C7-脱水(直接C15-羟基化方式)，另一种是先发生C7-脱水，同样由水合质子介导，然后发生C15-羟基化(间接C15-羟基化方式)。计算得到前者的能垒为17.9kcal/mol，后者的能垒为13.1kcal/mol。由此提出CYP512W2的反应顺序应为：催化C7位羟基化后，自发脱水生成GA-Y，然后催化C15位羟基化生成GA-Jb(图3)。
(a)C7S、C11S和C15S羟基化的过渡态结构和能垒;
(b)HLDOA分别为C7-和C11-构象的CYP512W2;
(c)C7构象的放大结构;(d)C11构象的放大结构。
为了更好了解底物选择性，进一步提高CYP512W2的活性，研究人员通过分子动力学模拟分析CYP512W2的底物选择性，并在此基础上筛选出一些关键氨基酸，进行单突变及组合突变实验验证（图4）。最终，成功地鉴定了对催化活性至关重要的关键残基(I108,M114,M213,L294和Y482)。对这些残基进行工程改造，使GA-Y和/或GA-Jb的产量成倍提高。对其机制深入研究发现，I108A突变可以增强C7和C15位优势构象的占比，从而提升CYP512W2的催化活性；Y482F突变通过增大底物的入口通道，M213R通过静电作用调控底物的位置，实现了对GA-Y和GA-Jb的产量调控。
(a) 细胞生长、(b)HLDOA积累、
(c)GA-Jb和(d)GA-Y产量。
该研究通过对CYP512W2催化机制的分子解析和关键残基的鉴定，为定向高效合成灵芝酸及其合成途径的全面解析奠定基础。该研究工作得到了科技部重点科发计划（2018YFA0900600和2021YFC2100601）和国家自然科学基金（31971344和32270038）等项目的支持。特别感谢上海交通大学生命科学技术学院仪器共享平台和上海交通大学超算中心π2.0集群平台提供的技术支持。
论文链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acscatal.3c04440