基因毒性杂质判断及限度计算方法
转自：药事纵横
一、判断是否为基因毒性杂质
1.通过基因毒性杂质警示结构结合网站查询判断
1.1通过警示结构判断见附件[1]
1.2通过ECHA、CEBS、日本职场安全网站等判断
1.2.1ECHA网站查询
（1）通过网址http://maintenance.echa.europa.eu/进入，输入CAS号或者药物英文名。
（2）点击红框内容进入
（3）点击基因毒性信息--体内基因毒性
（4）查看结果：positive（有基因毒性），negative（无基因毒性）
1.2.2CEBS网站判断
（1）通过网址https://manticore.niehs.nih.gov/cebssearch进入，输入CAS号或者药物英文名。
（2）点击生物测定基因毒性结论（BioassayGenetoxConclusion）
（3）输入CAS号进行搜索
（4）查看结果（positiveornegative）
1.2.3日本厚生劳动省（职场安全网站）
通过网址https://anzeninfo.mhlw.go.jp/user/anzen/kag/sokatutbl.htm
直接搜索查看结果。
1.3CPDB数据库、PubChem数据库查询TD50、LD50计算限度
1.3.1CPDB网站查询TD50
（1）通过网址https://www.toxinfo.io/进入，输入CAS号或者药物英文名。
（2）点击CPDB进入查看结果(TD50)
1.3.2美国国家药品图书馆网站中PubChem数据库查询LD50
（1）通过网址https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/进入，输入CAS号或者药物英文名
（2）点击毒性（toxicity）进入
（3）查看毒性数据（给药方式、实验动物、半数致死量LD50）
2.世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物清单、国际癌症中心最新的致癌物文件明确哪些具有致癌性。
3.高度关注的危险物质如类黄曲霉素、N-亚硝基化合物和氧化偶氮结构
二、基因毒性杂质限度计算方法
1.PDE（允许的日接触量）方法
1.1这种方法主要是针对有充分阈值相关机理证据的遗传毒性化合物杂质限度的确定。参照残留溶剂限度(ICHQ3C)[3]的计算方法，PDE是由大多数相关动物研究中的未观察到作用水平（NOEL）或观察到作用的最低水平（LOEL）得出的，PDE首选用NOEL得出计算。如果没有NOEL值，可用LOEL。如下：
PDE——允许的日暴露量
NOEL——无毒性反应剂量
校正因子（F1、F2、F3、F4、F5）的相关说明参见残留溶剂限度(ICHQ3C)
体重调整假设任何成年人的体重为50kg（不论性别），如果专供儿童使用的处方中含有溶剂，针对较轻的体重进行调整或许是合适的。
1.2通过PubChem网站https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/查询LD50计算NOEL
计算公式：NOEL=LD50/2000
PDE=NOEL*50kg/（F1*F2*F3*F4*F5）
基因毒性杂质限度（ppm）=PDE/最大日服用剂量
举例：NEIPA（N-亚硝基二异丙胺）：CPDB数据库中未收载NEIPA的毒性数据，通过查询美国国家药品图书馆网站中PubChem数据库，得到NEIPA的大鼠经口给药LD50为1100mg/kg。计算：
NOEL（无可见影响水平）=LD50/2000=1100/2000=0.55mg/kg/天
PDE=0.55mg/kg/天*50kg/（5*10*10*10*1）=5.5µg/天（由于NOEL系由大鼠经口LD50计算而来，可知F1为5，F2为10，F3为10，F4为10，F5为1）
NEIPA（N-亚硝基二异丙胺）限度(ppm)=5.5µg/天/32mg*103≈170ppm（公司为更严格控制，控制限度为0.3ppm）
1.3由ppm计算相应NOEL、LOEL
有些时候我们查到的相应药理毒理研究数据（特别是某些低沸点溶剂）是研究空气中特定含量的吸入产生的效果，其单位常见的是ppm为体积比。通过查询毒性论文及数据库查询ppm，计算限度。
举例：由ppm计算相应LOEL—异丙基苯
F344大鼠以吸入途径暴露在异丙基苯浓度为250、500或1000ppm的空气中，6小时/天，5天/周，为期2年。在所有剂量水平，雄性动物鼻呼吸道上皮腺瘤、肾小管腺瘤或癌（组合）的发生率均增加。在所有剂量水平下，雌性动物鼻呼吸道上皮腺瘤发病率增加。
异丙基苯的分子量：120.19
LOEL为250ppm（未建立致癌作用的NOEL）
250×120.19/24.45=1229mg/m3=1.23mg/L，24.45为25℃气体摩尔体积。
对于持续给药=1.23×6×5/24/7=0.22mg/L
日摄入总量=0.22mgL-1×290L/天/0.425kg=150mg/kg/天
大鼠呼吸量：290L/天
大鼠体重：0.425kg
PDE=150×50/(5×10×1×10×10)=1.50mg/天
限度=1.5×1000/10=150ppm
举例：由ppm计算相应NOEL-三乙胺
F344大鼠（50只/组/性别）经全身吸入暴露于0、25或247ppm（0、0.10或1.02mg/L）的TEA，6小时/天，5天/周，为期28周（15）。在所有剂量组中，未观察到有统计学显著性的治疗相关的系统性影响。虽然检出雄性大鼠的体重出现略微剂量相关性下降，但体重增加无统计学影响。这项研究的未观察到作用水平（NOEL）为247ppm。
三乙胺的分子量：101.19g/mol
NOEL为247ppm
247ppm=247×101.19/24.45=1022.2mg/m3=1.022mg/L，24.45为25℃气体摩尔体积。
对于持续给药=1.022×6×5/24/7=0.183mg/L
日摄入总量=0.183mgL-1×290L天-1/0.425kg=124.9mg/kg/天
大鼠呼吸量：290L/天
大鼠体重：0.425kg
PDE=124.9×50/(5×10×2×1×1)=62.5mg/天
限度=62.5×1000/10=6250ppm
1.4由TD50（半数中毒剂量）计算PDE
通过CPDB数据库（https://www.toxinfo.io/）网站查询TD50。
计算公式：
举例：环氧氯丙烷（具有基因突变的警示结构），控制限度如下计算：
大鼠实验TD50为2.96mg/kg/day
按照1/100000肿瘤发生率，TD50为1/50000的发生率
2.96mg/kg/day÷50000=0.0592μg/kg/day
0.0592μg/kg/day×50kg(体重)=2.96μg/人/day
即PDE为2.96μg/人/day
基因毒性限度（ppm）=2.96μg/人/day/0.03=98.67ppm≈100ppm
利伐沙班的每日最大服用剂量为30mg，那么环氧氯丙烷的控制限度为100ppm.
2.TTC（可接受风险的摄入量）法（依据:EMA《遗传毒性杂质限度指南》[4]）
此种方法用于未查询到毒性数据（LD50、TD50）、无充分阈值相关机理证据的遗传毒性化合物，但高度关注的危险物质（类黄曲霉素、N-亚硝基化合物和氧化偶氮结构），致癌性明确，TTC1.5μg/日不适用于这类物质[5,6]。
计算公式：
基因毒性杂质限度（ppm）=TTC（μg/day）/MDD（最大日服用剂量）（g/day）
如果给药是间歇性的，则可接受日摄入量应根据给药总天数计算，而不是服用药物的总时间长度计算（例如，2年期间每周服用一次药物，即104个服药天数，其可接受日摄入量为20μg）。
3.含有多个遗传毒性杂质的限度要求
基于TTC原理，当原料药中含有多个遗传毒性杂质时（3个及3个以上），按照表2所描述的进行限制。TTC根据治疗期进行判断。
计算公式：基因毒性杂质限度（ppm）=TTC（μg/day）/MDD（最大日服用剂量）（g/day）
4.高度关注的危险物质如：类黄曲霉素、N-亚硝基化合物和氧化偶氮结构（参见CDE、欧盟发布的相关文件、毒性确证文献）[7]
4.1能在权威机构数据库中查找到TD50值的亚硝胺类杂质
AI=TD50（mg/kg/天）×50kg/50000
限度=AI/每日用药量
4.2未在权威机构数据库中查见TD50值的亚硝胺类杂质
(1)可以参考国际权威机构，如WHO、国际化学品安全性方案（InternationalProgrammeonChemicalSafety，IPCS）等公布的数据或建立的风险评估方法。
(2)与已有TD50值的亚硝胺类杂质结构相似，可以导用其TD50值计算杂质限度。
参考资料
[1] 基因毒性杂质之警示结构（欧洲）文件（Developmentofstructuralalertsfortheinvivomicronucleusassayinrodents）
[2]关于在原料药工艺中生成亚硝胺类化合物的风险警示（CDE发布）
[3] 人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH协调指导原则)Q3C(R7)：杂质：残留溶剂的指导原则
[4]EMEA基因毒性杂质限度指南-百度文库https://wenku.baidu.com/view/df144e93caaedd3382c4d381.html
[5]人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH协调指导原则)M7：评估和控制药物中DNA反应性（致突变）杂质以限制潜在的致癌风险
[6]基因毒性杂质genotoxic -百度文库https://wenku.baidu.com/view/5933346bd1f34693dbef3e9b.html
[7]国家药监局药审中心关于发布《化学药物中亚硝胺类杂质研究技术指导原则（试行）》的通告（2020年第1号）