蜂蜜中二羟基丙酮、甘露糖和蜜二糖的测定（BJS 202307）解读
转自：中国市场监管报
蜂蜜是一种营养丰富的天然食品，在我国有悠久的食用传统。蜂蜜同时也被《中国药典》和《既是食品又是药品的物品名单》收录，具有一定的医疗保健功能。因此，蜂蜜深受我国消费者青睐。但是，由于蜂蜜的主要成分和糖浆高度相似，不法商家在蜂蜜中掺入糖浆，甚至存在完全以糖浆冒充蜂蜜的现象。
对于蜂蜜行业，如果劣质掺假蜂蜜以极低的价格冲击市场，可能导致劣币驱逐良币，真正的天然蜂蜜因为成本较高反而滞销，引发蜂蜜生产企业生存艰难、蜂农转行等问题。所以说，蜂蜜造假问题不仅是一个商业欺诈问题，更会影响到整个行业的生存和发展。
随着蜂蜜造假技术的不断升级和对检测方法的针对性破解，国内现行的蜂蜜真实性检测标准已经不能满足当前的检测技术要求。为维护广大消费者权益，2023年6月，市场监管总局发布食品补充检验方法《蜂蜜中二羟基丙酮、甘露糖和蜜二糖的测定》（BJS202307），该方法将有助于监管部门对市场上销售的蜂蜜进行风险监测和数据积累，为后续执法监管提供技术支撑。
适用范围
中国地大物博，植物资源丰富，蜂蜜品种也多种多样。按照蜜源植物分类，中国的蜂蜜品种主要有油菜、洋槐、荆条、椴树、枣花。相关行业调研显示，这几种蜂蜜的年产量可以占到蜂蜜年产总量的一半以上。此外，方法起草单位从市场上购买了113款蜂蜜，油菜、洋槐、荆条、椴树、枣花5个蜜种占55.6%，其他蜜种占44.4%。考虑到市场占有率及方法验证对实验样本数据量的要求，该方法适用的蜜种定为油菜、洋槐、荆条、椴树、枣花。
技术路线的选择
根据文献调研，检测蜂蜜中糖类成分的方法包括液相色谱-示差折光检测法、液相色谱-蒸发光散射检测法、离子色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法、核磁共振波谱法等。
其中，液相色谱-示差折光检测法是检测糖类成分最为经典的方法。但是，示差折光检测器对温度变化非常敏感，基线稳定时间长，不能梯度洗脱，色谱分离效果不好，检测灵敏度也较低。液相色谱-蒸发光散射检测法灵敏度较高，色谱分离效果较好，但是重复性较差；离子色谱法灵敏度较高，分离效果较好，但是色谱柱等实验耗材价格昂贵，离子色谱仪在国内实验室的普及率也不高；液相色谱-质谱法的灵敏度非常高，但是液相部分对糖类的分离效果较差；核磁共振波谱法优点在于快速、无损、可重复性高、全扫描，但是仪器成本和维护费用昂贵，对仪器操作和数据分析人员的专业技术要求较高。气相色谱-质谱法的气相部分色谱柱柱长远大于液相色谱柱，通过前处理衍生化，对糖类的分离效果非常好；质谱作为检测器，灵敏度也非常高；此外，气相色谱-质谱仪在国内实验室的普及率也较高，满足标准方法的广泛适用性要求。综上所述，本方法采用气相色谱-质谱法对蜂蜜中的糖类进行检测分析。
方法前处理
由于糖类属于不挥发性物质，需要在前处理阶段进行衍生化反应，本方法采取两步衍生。因为蜂蜜中的还原糖存在闭环和开环结构，直接硅烷化衍生会产生多个异构体衍生化产物，使得每个糖类化合物在色谱图上出现多个色谱峰，不利于后续数据分析。因此，在硅烷化反应前增加肟化反应，使得环化反应受限，减少异构体衍生化产物的生成。根据文献调研和实验验证，本方法选择盐酸羟胺作为肟化试剂，N,O-双（三甲基硅基）-三氟乙酰胺作为硅烷化试剂。
此外，需要注意的是，由于减压干燥不完全导致的水分残留会使得硅烷化效率降低，影响后续检测。所以，需要优化减压干燥条件，保证乙醇和水的完全挥发。根据实验验证，本方法减压干燥温度设定为40℃，减压干燥时间建议不少于12h。
基质效应考察
分别采用基质标准曲线定量和溶剂标准曲线定量方法对荆条蜂蜜、油菜蜂蜜、枣花蜂蜜、椴树蜂蜜、洋槐蜂蜜进行定量，通过计算添加回收的准确度评价基质效应。结果表明，二羟基丙酮不存在基质效应，甘露糖和蜜二糖存在较强的基质增强效应。所以，对二羟基丙酮、甘露糖和蜜二糖的定量检测需要以基质标准曲线进行。
分别选取空白油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜配制基质曲线，用于5种蜂蜜样品中二羟基丙酮、甘露糖和蜜二糖的测定。通过计算添加回收的准确度评价不同蜜种之间基质效应的差异，结果表明，不同蜜种之间基质效应没有显著差异。所以，可以任意选择空白油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜配制基质曲线用于结果的测定。椴树蜂蜜中二羟基丙酮本底含量较高，枣花蜂蜜中二羟基丙酮和甘露糖本底含量较高。当以这两种蜂蜜配制基质曲线时，较高的本底会导致线性方程的截距过大甚至于完全不呈线性，无法进行结果计算。所以，不建议以这两种蜂蜜配制基质曲线。
其他需要注意的问题
由于蜂蜜样品中含有大量的糖类物质，而且前处理方法中存在衍生化步骤，所以气相色谱-质谱法在检测样品数量较多时，对气相色谱-质谱仪的污染较大，容易造成仪器状态下降。因此，建议加大对气相色谱-质谱仪的维护频率，以保证色谱峰的分离度和定量结果的准确性。
□南京海关动植物与食品检测中心陈磊