直播问答 | 第41期《浅析微生物发酵原料药的注册》
转自：注册圈
01圈友：
对于半合成的原料药，起始物料的前序路线含一步发酵步骤，制剂为口服途径，原料药需要进行DNA残留和蛋白残留的检测吗？
老师：
我觉得可以在起始物料去控，也可以在API当中去控，我觉得基于现在中心的要求来讲，应该还是会要求对蛋白进行控制。蛋白和DNA的残留控制方法,实际上药典当中是有的。但是它可能不会直接写蛋白残留，可以去搜一下，无论是欧洲药典还是中国药典，它在蛋白残留或者是紫外法都会有很多种控制蛋白残留的方法。包括一些茯苓酚试剂法，包括一些双缩尿，亮马斯考蓝，还是一些其他衍生的方法，实际上都可以把蛋白残留。包括核酸是在260纳米下测吸光度吧，我有点忘了，应该都是可以去控制的，这方面大家可以有目的的去收集一下。
那么限度定到多少，刚才我在讲的时候也提到了，有一些药检所的老师发过一些文章，你的限度肯定不可能高于这些公开的文献发表的东西。另外药典当中有一些控制是有限度的，这些限度推算一下或者是思考一下，也能够计算出来它相应的限度，这些也都可以作为参考的依据。因为蛋白和DNA这种核酸的残留，它不是特别精确的,针对性的一个检测，所以这样一个检测的灵敏度有的时候也不是很高，所以说有的时候要尝试多种不同的方法，找到一种不干扰的方法，对它进行检测，我觉得这样才能达到目的。
对于这种半合成的原料，如果起始物料，比如说就是7ACA，我觉得你在7ACA当中是不就需要控制，如果你的7ACA控制的真实检出含量比较高，在最终API当中有可能还是需要对它进行检测。当然你做到低于检测线以下，我觉得你的最终的API当中就可以不控。如果最终API的检测线很高，或者是有检出的话，我觉得中心要求你进入成品的质量标准都是有可能的。
02圈友：
6APA和7ACA作为起始原料，合成比如舒巴坦钠，他唑巴坦钠等，需要对6APA的研究相比一般化工产品作为起始原料有哪些更具体的研究？
老师：
实际上我刚才也说了，把6APA作为起始物料的话，刚才我们说的发酵当中的这些产品，有可能都需要在起始物料的内控标准当中对它进行控制。现在我们化药生产工艺信息表当中也很明确，要放入中国药典格式的，起始物料的质量标准，在座的应该都是被CDE有提到这样的要求，显然如果中心要求你把这些放到你的6APA或者7ACA里边，它们就一定会被带到化药工艺生产信息表里面，它就会固定下来，我想很多企业是不希望见到的。但是想逃过去，据我所知不太容易，现在中心对这块看得还是很重的。更具体的研究，我觉得你可以把它实际上当做小原料药进行研究，对于半合成的产品来讲，对于6APA和7ACA来讲。
03圈友：
如何定义发酵工艺关键中间体？注册资料的过程控制部分，是只需要交关键中间体的标准，还是其他生产过程控制项目的标准也需要交？
老师：
这个问题可能没有一个特别统一的答案。发酵工艺关键中间体，我觉得可能从两个方面，一个是半合成原料药里面提到的可分离的中间，另外生产工艺当中就像之前提到的，你的出品,第一次拿到可分离的干燥之后的出品或者是食品，显然它也是非常关键，甚至有的时候可能需要按照成品的质量标准对出品进行控制，这样你才能把杂质命运研究给串起来，否则是搞不清楚杂质在什么地方被去掉。
过程控制就是我们说的IPC3.2.S2.4，原则来讲过程控制这部分，要提供全部的中间体和过程控制的相关指标，原则上是需要全部提供的，当然有一些注册策略，就像我刚才说的,方块终检的案例一样，企业一般是不希望写太多，因为写太多了，就给后边的变更带来困难，监管机构是希望写的尽可能详细，可以更好的对你进行监管，所以这是一对相互之间有一些矛盾的点，写到多少是合适的，或者是哪些写哪些不写，我觉得这可能就是注册策略的问题了
当然这里不是鼓励大家说有意隐瞒什么，但有的时候确实有一些写的过于详细了，确实会给以后获批的生产带来一些不方便，但你写的如果不够详细的话，也就经常会被发补，也是逃不掉的。所以通常在这个地方，原则来讲，应该是提供所有的中间体和过程控制相关的指标，原则上是需要这么提供的。
04圈友：
发酵工艺产品的基因毒性杂质研究怎么做？
老师：
实际上这个问题是非常开放的，基因毒性杂质怎么做？Shm7当中有很明确的说法，对于发酵产品，我觉得它跟我们普通化学合成产品的区别，不在乎它的基因毒性杂质的限度有改变，而在乎它的基因毒性杂质的来源是什么。基因毒性杂质很有可能是你加入的底物，或者是你加入的一些成分，它可能会带有这样的警示结构。如果是这种情况，就针对性的去进行检测就好了，其它的跟我们平常的化学药品没有什么区别。
同样的道理，如果发酵过程中没有任何可以产生基因毒性杂质的可能，包括连硝酸盐也没有用，有的发酵当中会用硝酸盐和亚硝酸盐提供氮源，如果在这种情况下，可能还要讨论硝氨杂质的可能，否则如果你没用，比如说用其它的像尿素这种作为氮源，应该说几乎没有亚硝胺杂质产生的可能。如果用的水还是制药用水的话，这种就只是简单论述一下，我觉得这个问题实际它不是具体的问题，它是开放讨论的问题，你对你的工艺是最了解的，你就看你工艺当中是不是可能引入或者产生基因毒性杂质就好了。
05圈友：
发酵原料药工程菌种来源合规性及菌种鉴定应如何做？做到什么程度？比如从非专业机构购买的工程菌种，是否合规？或者如何做能合规？
老师：
非专业机构应该指的就是非atcccmcc这样的机构购买的工程菌种是否合规。首先从任何企业或者来源买到菌种，只要是合法来源，我觉得都是合规的。如果是非合法来源，就是另外一回事了。实际上在现实中的菌种应该都来自于科技公司，它是不会把他的菌种的全系列或者是一些核心的机密提供给你的，这个是可以理解的，因为他就靠这个生存。和我不会把我的资料作为讲课课件给大家提供是一样的，这是它生存的根本。
在这种情况下你该怎么办？这种情况下就会很被动。如果你只有购买证明，没法提供工程菌详细的信息，包括它的质粒信息，包括甚至它的DNA全序列的信息，一旦被中心发补，你就没法回复。所以现在好多企业在做这种品种的时候，有的时候可能会自己为自己研究工程菌，或者是通过更加合规，或者共同开发这样的方式去得到工程菌，这样才能够应对中心这样的要求。
如果像一些食品行业，之前对这方面没有要求，或者是没有准备，直接现在去报原料，遇到过这样的情况，就非常的被动，几乎是不可能回复的。因为他的合作客户一定是不会给他提供这部分核心的技术的，几乎是不可能给你提供的，所以这块要在产品开发的早期就预料到这一点，否则等到发补的时候就毫无办法。
06圈友：
半合成原料药的起始物料应如何控制，需要跟API一样控制么？
老师：
这个刚才实际上也提到了，像6APA，7ACA这样的东西它的控制，实际上就相当于一个小原料药，确实是需要的。包括它的有关物质，包括它的杂质，包括它的分析方法验证，这些都是需要去做的，都逃不掉的。如果你拿过来只做含量或者纯度，就往下去投，这个品种是没法批准的。
07圈友：
起始物料只有菌种的话，如何分析起始物料引入的杂质？是要研究所有代谢产物都是什么吗？
老师：
我刚才提到了微生物发酵的产品，它有几种来源，有的是微生物产生的酶类的成分，有的像玻璃酸钠这样是微生物的夹膜，链球菌的夹膜。有的氨基酸是我们天然的有基因缺陷的氨基酸，它没法完成氨基酸的闭合，卡到一个环节了，氨基酸就会不断的富集。有点像人类苯丙酮尿症的孩子，不能够代谢苯丙氨酸，只能产生苯丙酮酸。所以苯丙酮酸就在这样症状的孩子体内蓄积，并且产生毒性，实际上跟这个道理是差不多的。
我们可能有的时候要找先天有基因缺陷的这种细菌，或者通过人为改造，让它的氨基酸的合成卡到了一个环节所得到的产品。所以通过不同的原理，我们就会知道有的发酵的时候，这个产品的很多的情况下，你是不可能理想的只发酵你的产品。比如说像红霉素，发酵的时候一定是红霉素ABC三个组分在一起的，它不可能只得到红霉素a。当然它们的比例是不一样的，但相对来说也是非常的固定的，因为微生物有自己的生物合成，它们的组装是非常的精确和精密的。
所以对于这种发酵液，如果你的产品有紫外吸收，实际上是可以通过技术手段直接检测反应液，或者对反应液进行初步的处理以后，或者是深加工以后，去做一个类似于像指纹图谱一样的东西，这个东西是可以去尝试的。另外就是这样的一个要研究，比如说像玻璃酸钠一样，它就是夹膜的多糖的一个链，它所谓的杂质实际上就是不同的长短大小的玻璃酸钠。体现它分子量的大小和分子量的分布，所以对于这种发酵的产品来讲，我觉得很多情况下它的杂质谱相对来说是比较固定的。这些杂质的比例，还有产生都不会随便的变的，一般来讲不会是变的，特别是不会变好。应该正常来讲药典上的杂质，可能有一些会小一点，有一些会大一点。 所以我想对于发酵产品的杂质谱，它这种起始物料引入的杂质并不是菌种，当然你也可以讨论，我在菌种摇平和斜面的时候，我有对它有质量标准，包括没有杂菌的生长。这方面是属于菌种或者存在过程当中的质量控制，但是它跟我们化学合成当中，起始物料引入在杂质讨论的套路还是存在明显的区别。
08圈友：
发酵底物可以作为起始物料吗？
老师：
应该是两种情况下比较多，一种是发酵，让一些集团的构型发生反转，比如说鹅缺氧胆酸，通过两步的生物发酵。一步是羟基氧化成铜，另外铜再被还原成羟基。它就从左旋翻到了右边，从鹅缺氧胆酸得到了熊缺氧胆酸，这种情况下鹅缺氧胆酸可以定义为起始物料的。往里加的菌种和酶，实际上是发生酶促反应。它是催化剂的作用，这种情况下，可以把鹅缺氧胆酸定义为起始物料。
还有一种情况下，我们做的糖皮质激素类的。比如说我们的可滴松，直接发酵来的。当然它是从植物提取的产品经过化学处理之后得到的底物发酵来，后边可能会得到氢化可滴松、氟滴松、强滴松等等一大堆东西。所以可以把这种具有栽花结构的底物，把它定义为起始物料的。这种情况下，我们往里加入的菌泥、或者是酶、或者是微生物，实际上是起到了催化剂的作用，这种情况下就是可以的。但是比如说我们发酵一般的产品，比如像维生素类的产品，就不能把玉米和淀粉跟菌种当成起始物料，这个就不太合适了。
09圈友：
菌种稳定性需要递交哪些以及哪种程度的证明资料？
老师：
这个我实际上在我们注册圈6群里发了一个关于细胞库管理的质量规范的标准，您感兴趣的话可以去看一下，这方面确实没有特别多现成的法规。但是我刚才也说了一些生物制品的法规，其实生物制品在前边，原液的生产跟微生物发酵原料的发酵很接近，所以有一些东西也是可以参考的。
关于菌种的稳定性，一般从广义来讲有两种：一种是传代稳定性，一种是储藏期间的稳定性。储藏期间的稳定性，应该在GMP当中有相关的规定，您直接看GMP就可以了。传代稳定性主要是考虑原始菌种到工作菌种，到主细胞库，这样的传代和扩培的情况。我不知道大家有没有注意到，中国药典2020年版4部通则1106、1107，关于微生物限度这块也要求了，这样1个菌应该是传代不超过5代的，包括它f0带的定义，也在这里边有了。同样的道理，它为什么要做这样的规定？菌种在传代的过程当中，它有可能会发生退化或者是变异，这是自然界的规律。所以对于官方来讲，他不希望受这方面的影响因素会更加多。
所以我们来讲，为什么要求企业希望建这种三级细胞库，实际上原来很多企业只有两级细胞库，只有主细胞和工作细胞没有原始细胞。现在很多发酵也是有点参考生物制品的意思了，包括原始细胞库，主细胞库、工作细胞库要求签三级细胞库，包括相关的东西都要做起来，也有这方面的原因。传代稳定性也是一样，一般来讲至少得传5代，如果要5代都不稳定的话，坦白的说你没法生产。 所以菌种稳定性其实最主要的还是传代稳定性的研究，比如说你在传代5代10代或者其它代数之后，前后菌种的生理、生化、纤维、鉴别、DNA序列检测、发酵的指纹图谱，包括它的产量都没有发生明显的变化，这是我们要证明的。否则到时候工艺还是不稳定的，官方也肯定会给你发补，主要是关于菌种稳定性。
10圈友：
请问菌种遗传稳定性和生物学稳定性研究，是针对商业菌株的？还是工作菌株的？为什么要补充传代次数要求？
老师：
这个道理是一样的，我刚才说了中国药典当中都有规定，传代有规定。因为传代就是变异的积累，它也有可能会发生自己的退化，这个没办法，就是自然界的规律。但是至于你想要做，用什么阶段的组织库去做传代稳定性，实际上正常来讲，在你研究早期的时候。如果你把它纳入比如说原子细胞库主细胞库的界定里面的时候，也可以在那个阶段去做。后面正常来讲，我见到的可能还是做主细胞库的多一些，当然也有其他人去做。其它的菌库的传代稳定性，实际上跟你的工作菌库的定义也是有关的。
传代的次数刚才也说了，一般来讲至少要做到5-10代，这个可能要多一点，5代以内不满足生产要求，很快就可能就用完了，10代以上一般来讲也做不到，一般是做到5-10代要多一些。
11圈友：
发酵类原料药质量控制中的蛋白残留和核酸残留，应该参考哪些指导原则？
老师：
这个前面我也说到了，没有明显直观的指南，需要大家从多方面去寻找这方面相关的研究和参考、借鉴的意义和依据。
12圈友：
发酵类原料药如何在质量控制中体现培养基残留，该参考哪些法规？起始物料包括生产菌种吗？目前各国对转基因类生产菌种是否有要求，如产品中残留界限问题？在“体内代谢物的安全性风险很低”的认知情况下，如何不做毒理实验，阐述基因毒性？
老师：
这也没有法规，我们做注册没有那么多法规可参考的，很多时候是要实践的，这才是我们注册人员的价值。所以刚才也说了，要知道你培养基是什么，它是以什么形式残留到产品当中，然后去根据你的知识管理和相关的情况去制定针对性的检测方法。这个是这样的，而不是说法规规定豆饼残留是多少，花生残留多少，没有法规，所以你要去针对性的去做一些研究和讨论，而且不是所有的东西都需要去检测的。很多的时候可以通过讨论，可以把这件事情说清楚，但是如果没有讨论的话就会被发补。当然如果你知道这个套路，这些东西被发布了也不是什么难事，但如果要不知道，可能会非常的手足无措。
起始物料，包括生产菌种，刚才也说了我们对于传统微生物发酵，起始物料就是描述我们菌种的过程，对转基因类生产菌种是否有要求产品中残留界限问题？转基因的话，我理解的话就是你说的工程菌吧，这方面我也不是专家，但是我从工作当中我的感觉。如果你用的是工程菌，审评机构会更加的关注，比你来自于天然的、有明确的菌株这种清晰的要更加的严格的控制。你在菌种的来源，包括表达治法，包括遗传传代，包括控制各个方面，可能要比这种天然的菌株做的研究要更加深入一些才可以。
毒理实验基因毒性，我做的产品还没有涉及过。我刚才提到了一个概念，正好这里面说一下，我们很多菌种，鉴定实际上是要鉴定到株的，有很多只鉴定到了种，连数都没有，说不过去的。
13圈友：
如何合理的制定发酵产品的非特定杂质标准？
老师：
如果你要是确定是你的发酵产品的话，我觉得两个指南可以参考：一个是药典各论的要求，另外是欧盟EMA的抗生素指南，就参考这两个指南。FDA实际上还是有关于蛋白还有多肽类的指南，也可以参考，这个指南有时候也是有帮助的，有一些发酵产品也会落到这个指南上，那个可以看一下。
14圈友：
抗生素活性（效价）测定：药典没有列出申报品种的试验菌及试验条件，是否可以参照同类型产品的试验菌及试验条件，如否，应当如何检测，是否有推荐的指导原则推荐？
老师：
坦白的说我自己没有做过效价的测定，现在很多产品效价的测定慢慢的被一些液相、或者色谱方法所代替了。我之前有一个案例是，中国药典是效价，欧洲药典是色谱法，中心发补的时候还是建议我们用色谱法，对它进行控制而不是单纯用效价进行控制。
药典没有列出申报品种的试验菌及试验条件，是否可以参照同类型产品的试验菌及试验条件，如否，应当如何检测，是否有推荐的指导原则推荐？这个我确实是没有做过这方面的研究，所了解的也知之甚少，我所了解的是这方面还是经验性很强，就和我们做冻干，发酵的老工人一样，经验性还是很强的，我本人并不知道该怎么做。我只知道中国药典中的一些效价，如果国外药典当中有一些色谱法进行准确定量，中心可能会建议申请人改成直接测出的色谱法来进行含量的测定，这是我的一个建议，但具体的操作我确实不太知道。
15圈友：
发酵产品可以不设定中间体吗，杂质谱怎么分析？
老师：
发酵产品不设中间体的话我还真报过，中心也没有提出很多东西。因为确实有的时候产品就是在柱子上吸附来吸附去，最后完全存化了之后直接喷雾干燥，得到API，确实没有可分离的中间体。但是没有可分离的中间体，不代表什么都不做。每一步的中间过程控制还是能够跟踪产品的质量的，不是非得要离心干燥了以后拿到固体粉末在手里才能控制。所以我想这一块还是可以像我刚才说的那个思路，可以不设中间体，如果在你的情况下，但是该做的话还是需要去做。
杂质谱怎么分析呢？我刚才也说了，可以取中间过程控制中的反应液，按照成品的方法去进行检测，还是能够监控杂质的产生和去除的。特别是在早期阶段，对于过柱子这些监控的话我觉得正常研发都会做，可能随着你数据的积累，你可能在生产当中不用实时的监测或者实时的控制，这些数据你应该是有的。如果你要没有的话，我只能说要不就是工艺是有基础的，要不就是不想体现那么多东西。实际上一个合理的过程，这些东西都是要有的。
16圈友：
多组分的发酵类原料药需要对各个组分都进行立体结构鉴定吗？
老师：
这个我实际上坦白地说，我遇到的案子的话还没有遇到过这样，因为进行多组分原料药的话。比如说像红霉素，红霉素ABC，中国药典是有红霉素ABC的对照品的，所以我们结构确证的时候，而且红霉素A应该是占到了98%，我没记错的话，所以他那么大的一个分子量当中的侧链是甲基还氢，并不会改变结构确证的核磁和质谱的结果，所以没有对它进行热别的鉴定。当然如果你遇到的产品很特殊的话，有的时候是不是可能需要你综合多种去进行鉴定。比如说官方的法定对照品，比如说你质谱的情况，有可能这方面是需要进行鉴定的。
由于法规不断变更，部分解答或许有所偏差，如若发现烦请留言！