疏水标签蛋白降解新工具——降冰片烯
转自：药渡
疏水标签技术（HydrophobicTag,HyT）是靶向蛋白降解技术的一支，由PROTAC技术先驱CraigM.Crews于2011年提出。疏水标签可模拟错误折叠的蛋白质，从而招募伴侣蛋白或蛋白酶体来降解POI。相比PROTAC来说，其具有分子量更低、成药性更好，无沙利度胺衍生物的致畸风险等优势，是一项极具前景的TPD技术。
目前已经开发出了包括金刚烷、芴、芘、碳硼烷等疏水标签，并成功实现了HER3、AR、EZH2、PAPR1等POI的降解，然而现有的疏水标签仍存在理化性质差、易消除、生物利用度低、降解效率不高等缺陷，这阻碍了疏水标签技术的大规模运用和临床开发。针对以上问题，中国药科大学的徐盛涛/徐进宜教授课题组开发了一种全新的疏水标签——降冰片烯，及对应的疏水标签降解分子Hyt-9，Hyt-9的生物利用度达到了8.6%并表现比ALK抑制剂alectinib更强的抗肿瘤活性。
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疏水标签及linker的设计和优化
课题组在前期对ALK抑制剂alectinib优化改造中得到了ALK抑制活性更优、结构改造空间更大的化合物A3，即图2中的红色ALKbindingmoiety，然后以A3为POI的ligand筛选了不同的疏水标签（如苯、芴、Boc保护的精氨酸、油酸和降冰片烯等）以及连接二者的linker，通过亲和力、IC50以及ALK蛋白降解效率对不同的Hyt分子进行了表征和筛选，发现了优选分子Hyt-7，其在0.5μM下的降解效率达到了70.4%，且是迄今为止报导的分子量最小的疏水标签降解分子。接着在Hyt-7的基础上对linker长度进行筛选，得到了细胞和蛋白活性均更优的化合物Hyt-9。
对Hyt-9进行更细致的实验测定后发现，Hyt-9以剂量依赖性的方式诱导ALK蛋白降解，1μM下的最大降解效率达95%，在给药24h后的DC50达到了134nM，而之前所报道的其他疏水标签降解分子的活性均仅在微摩尔水平。此外，Hyt-9可以在50nM的低浓度下实现H3122细胞中ALK磷酸化的100%抑制。
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降解机制及体内安全性/有效性
免疫荧光显示Hyt-9处理H3122细胞24小时后，ALK蛋白以及磷酸化的ALK蛋白荧光强度均显着降低；实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)显示Hyt-9处理后ALK的mRNA水平与对照组相比并无变化，但在ALK抑制剂alectinib的处理下ALK的mRNA水平却升高了2倍。流式细胞分析则发现Hyt-9降解ALK蛋白后通过诱导强烈的细胞凋亡从而导致肿瘤细胞死亡。与此同时，还进行了rescue实验以验证Hyt-9经由何种降解途径实现ALK蛋白降解，在蛋白酶体抑制剂MG-132(2 μM)的预处理下，Hyt-9无法再诱导ALK蛋白降解，而在溶酶体抑制剂氯喹的预处理，Hyt-9的诱导降解能力得到保持，证明Hyt-9通过蛋白酶体途径发挥作用。进一步的，采用pulldown实验对伴侣蛋白Hsp70进行检测，发现Hyt-9诱导的ALK蛋白降解是通过使ALK不稳定来实现的，并且在不直接结合Hsp70的情况下将其募集，并运输到蛋白酶体进行降解。
Hyt-9的PK/PD实验表明，其在小鼠和人血浆中极其稳定，以1mg/kg单次IV给药后的可以达到200.4ng/mL的最大血浆浓度，血浆清除率为41.4mL/min/kg，半衰期为4.29h，口服时半衰期达5.45h，生物利用度为8.6%，相比基于alectinib的PROTAC，药代动力学性质显著改善。
对H3122异种移植小鼠进行为期21天的Hyt-9给药后发现（口服20mg/Kg，静注10mg/Kg），Hyt-9治疗组小鼠的肿瘤体积和重量均显著降低，肿瘤生长抑制率约为50.7%–65.9%（图5A），Hyt-9也未表现出体重减轻或其他任何毒副作用。
03
降冰片烯作为疏水标签的通用性
为了验证降冰片烯作为疏水标签的通用性，将其他两种ALK抑制剂色瑞替尼和布加替尼、以及EZH2抑制剂Tazesistat以短酰胺linker与降冰片烯连接，设计合成了两种ALK降解剂 Hyt-11、Hyt-12和一种EZH2降解剂Hyt-13，均成功实现了对目标蛋白的降解，且依然是通过蛋白酶体途径降解的。 Hyt-11、Hyt-12、在24h时的DC50分别达到了314nM、89nM，Hyt-13的抗增殖活性则相比Tazesistat提高了12倍。
总结
除PROTAC以外，目前报导的TPD技术还包括溶酶体靶向嵌合体(LYTAC)、基于抗体的PROTAC(AbTAC)、自噬靶向嵌合体(AUTAC)及自噬体束缚化合物(ATTEC)等。然而由于分子量较大，这些技术在成药性方面仍然面临一定挑战。而在AngewandteChemie这项研究中，作者发现了一种新型的疏水标签降冰片烯，成功实现了ALK和EZH2目标蛋白的降解，并且在小鼠体内实现了不劣于对应小分子抑制剂的抗肿瘤疗效及安全性。更为难能可贵的是，作者开发的疏水降解剂Hyt-9分子量仅为604，是有史以来报道的最低分子量的蛋白降解剂，可以实现口服给药并表现出可接受的生物利用度。同时，疏水标签降冰片烯应用于其他靶点的降解也极具潜力，值得我们进一步的研究和探索。
参考
[1]Neklesa,T.,Crews,C.Greasytagsforproteinremoval.Nature487,308–309(2012).
[2]XieS,ZhanF,ZhuJ,SunY,ZhuH,LiuJ,ChenJ,ZhuZ,YangDH,ChenZS,YaoH,XuJ,XuS.DiscoveryofNorborneneasaNovelHydrophobicTagAppliedinProteinDegradation.AngewChemIntEdEngl.2023Mar20;62(13)
作者：LYQ