一个“巴掌”拍不响，一种新的CAR-T治疗实体瘤的方法
转自：药时空
T细胞有两种CAR，针对两种肿瘤特异性抗原（TAA），两种CAR带有不同的传导信号激发因子。只有两种CAR同时结合两种TAA，才能共激发对肿瘤杀伤效应的信号转导称为AND；一旦结合一种正常细胞表达的抗原就不激发称为NOT；结合一种TAA就激发称为OR。
图1：BooleanLogicGate对于CAR-T控制的示意图 [1]
最近的一篇来自于斯坦福大学的NATURE文章中[2]，作者使用ZAP-70（一种细胞内近端T细胞信号分子）取代传统的CD3ζ结构域分子，可以激活T细胞并在体内根除肿瘤，同时可以绕过上游信号传导。ZAP-70的主要作用是磷酸化LAT和SLP-76，于是将LAT和SLP-76设计成基于AND的逻辑门控细胞内网络（LINKCAR）。但是从这篇文章来看，这种AND设计并不是一帆风顺的。
这篇文章评估CAR-T细胞杀伤作用的主要方法用到了大家耳熟能详的Incucyte®实时活细胞分析系统，Incucyte®也成为这篇NATURE的核心技术。
Incucyte®检测方法
仪器类型：Incucyte®S3
细胞自带红色荧光或者绿色荧光，每隔3个小时拍摄一次，共拍摄72小时，计算积分荧光面积的时间曲线。
图2：使用Incucyte® 进行免疫细胞杀伤实验，细胞质快速标记染料及细胞健康试剂（非本文实验图像）
评判标准：CAR-T只杀伤CD19、HER2双表达的细胞，对不表达或者单表达的细胞系不杀伤。体现在Incucyte®的动态图谱上，就是曲线向上的速度越快代表越不杀伤，非常直观。
在设计AND逻辑门的CAR时，一个关键问题是如何避免出现自发二聚体，降低肿瘤杀伤的特异性作用。
首先，是对不同跨膜域的选择，考虑到如果用同样的跨膜结构域可能会产生二聚体，所以应尽量使用不同的跨膜结构域。基于此，作者首先研究了AA，BB，AB，BA四种跨膜域组合（A为CD28TM，B为CD8TM）。
图3：Incucyte®实验显示,只有CD19-28TM-LAT+HER2-8TM-SLP-76（AB组合）显示出了一定的AND作用，但是仍然杀伤了CD19单阳。
为了进一步降低同源二聚或者异源二聚的可能性，突变了CD28TM上的一个半胱氨酸位点（2CA），但是仍然无法提高特异性。
图4：Incucyte®实验显示，2CA突变没有提高特异性，依然对CD19单阳有杀伤
LAT和SLP-76不会结合，为什么还是不行呢？作者进一步研究了这个信号通路发现，下游的一个适配分子GADS，可能会同时和两个CAR结合，所以依然会形成二聚体。所以将两个CAR上的GADS结合位点的敲除后，特异性就提高了，真正获得了AND效果！
图5：Incucyte®实验显示：GADS结合位点敲除后获得了只对双阳杀伤的效果。
当然作者也尝试了其他抗原组合，比如CD19和ROR1，这种LINKCAR依然有效！
图6：Incucyte®实验显示：2CA和GADS双突变的LINK只会杀伤ROR1和CD19双阳的细胞系
当然这种AND效果方法不只一个，比如SynNotch，但是相对于SynNotch，这篇文章的LINK显示出更佳的特异性。
这种CAR可以扩大CAR-T细胞靶向的分子范围，并将使CAR-T能够用于实体瘤和自身免疫等疾病和纤维化。此外，这项工作表明，细胞的内部信号机制可以重新利用为表面受体，其可能为细胞工程开辟新的途径。
为什么越来越多的高分文章
都使用了Incucyte®？
培养箱内可长达数周的连续观察，最短几分钟间隔拍摄，减少人力，防止过多操作对细胞的伤害；本文每隔2个小时拍摄，拍摄3天。
6个板位，分别独立设置检测程序，可以兼容各种孔板和培养皿，通量高；本文有各种细胞系、CAR等实验组，Incucyte®一次可以完成所有实验组实验
高效简便的模块化软件设置和数据分析，输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数；本文提到了使用Incucyte®多个参数的调节，使得结果更加准确
大于100种优化过的活细胞专用荧光试剂、耗材及详尽的Protocol；文章数大于13,000篇，是长时间活细胞成像主流设备之一
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-参考文献-