单细胞多组学交叉分析 揭示肾透明细胞癌关键调控程序
洪恒飞科技日报记者江耘
肾细胞癌起源于肾小管上皮的恶性肿瘤，是泌尿系统的常见肿瘤疾病，发病原因尚不明确。根据国际癌症研究中心数据库GLOBOCAN统计，2020年全球肾细胞癌的发病率居恶性肿瘤第14位，死亡率居第15位。其中，中国新发肾癌约7.3万例，且仍呈上升趋势。
肾透明细胞癌则是肾细胞癌中最常见的病理亚型。由于其复杂的肿瘤微环境，当前多种临床治疗策略的临床表现仍有待提升。深入刻画肾透明细胞癌微环境中的细胞组成和基因组调控特征，对于理解肿瘤致病机理和开发新的治疗策略具有重要意义。
不久前，浙江大学医学院附属第二医院泌尿外科文甲明主任医师、王博涵副主任医师课题组联合西湖实验室谢琦研究员团队，利用单细胞多组学技术揭示了肾透明细胞癌中的关键调控程序，发现潜在的治疗靶点。相关研究论文发表在国际期刊《细胞发现》。
勘察肿瘤微环境需要打开新视角
由肿瘤细胞、免疫细胞、间质细胞、细胞外基质及各种因子构成的肿瘤微环境，是非常复杂的生态环境。肾透明细胞癌的肿瘤微环境具有高异质性：同一恶性肿瘤在不同患者个体间或者同一患者体内不同部位肿瘤细胞间以及不同临床阶段中，都存在很大差异，使得靶向治疗和免疫治疗对一部分患者初始就不敏感或者最终产生耐药性。
所谓靶向治疗，是指在细胞分子水平，针对主要的致癌相关分子设计相应的治疗药物，药物进入体内后特异性选择致癌分子发生作用，下调受体的表达或下游基因的活化，达到程序化逆转肿瘤细胞分化的能力，或间接靶向肿瘤新生血管，使肿瘤细胞缺血而死亡。
“肾癌的靶向治疗药物主要有两大类，一类是以血管内皮生长因子受体为靶点的酪氨酸激酶抑制剂，另一类是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白。”文甲明介绍，这两类药物都能起到抗血管生成的作用，从而治疗肾癌。
肾癌的免疫治疗主要依靠免疫检查点抑制剂。免疫检查点是免疫细胞产生的调节自身免疫功能的蛋白小分子，一类免疫抑制性的分子，可以调节免疫反应的强度和广度，从而避免正常组织的损伤和破坏，在肿瘤的发生发展过程中，免疫检查点成为免疫耐受的主要原因之一。
“无论是单一的抗血管生成靶向药物，还是单一的免疫检查点抑制剂，或是两者联用，目前表现都是在部分患者中有一定疗效，但在一部分患者无明显获益，甚至出现较为明显的毒副反应。”文甲明说。
近年来，单细胞测序技术飞速发展，已经能够检测出单个细胞的基因转录表达和表观基因组调控等多种维度的信息。
文甲明表示，这种单细胞水平的多维度信息能够以更高分辨率和更广的视角来帮助解析组织发育和疾病发生发展的关键因素，或是肾透明细胞癌肿瘤微环境的有利勘探工具。
肾透明细胞癌的单细胞转录和染色质可及性图谱科研人员供图
从数万个单细胞中识别特殊蛋白质
此前，国外科研团队曾针对健康的肾脏组织，运用单细胞核转录组测序(scRNA-seq)和单细胞染色质可及性实验技术(scATAC-seq)，刻画过在肾脏发育过程中基因表达和表观基因组调控的特征，并识别出驱动肾小管细胞分化和近端小管上皮细胞亚群转换的关键调控因子。
“以往的研究并未在基因组水平刻画肾透明细胞癌的特征，联合团队尝试直接应用单细胞多组学技术来解析肾透明细胞癌，进一步打开肾透明细胞的单细胞多维度视角。”文甲明表示。
此次研究中，联合团队具体采用了4例肾透明细胞癌患者的手术标本进行研究，对患者的肿瘤组织进行了配对的scRNA-seq和scATAC-seq测序，分别获得的38，097和21，272个单细胞。
通过单细胞数据分析，联合团队识别了多种淋巴细胞和髓系细胞亚群联合肾透明细胞癌标志基因CA9和拷贝数变异特征，在两种数据类型中各鉴定出了一个肿瘤细胞群体。
“总的来说，实验获取的单细胞中，免疫细胞是肾透明细胞癌微环境中主要的细胞群体，占比大于70%，肿瘤细胞只占不到10%，还有一些正常组织细胞。”文甲明介绍。
通过设计严格的筛选策略，并结合公开的人类癌症基因组图谱计划数据库（TCAGA-KIRC），科研人员识别了4个肿瘤细胞特异富集且显著和病人更差预后生存相关的转录因子，具体为蛋白HOXC5、VENTX、ISL1和OTP。
基于scATAC-seq捕获到的染色质开放信息，科研人员进一步识别出了这些转录因子的下游靶基因并构建了其表观调控网络，分析发现，这些转录因子的靶基因显著富集于低氧和细胞增殖信号通路，且包含多个在肿瘤细胞群体中显著高表达的基因FXYD2和CRYAB。
此外，结合先前的scRNA-seq数据，科研人员发现这些靶基因特异性地富集于肿瘤细胞群体。
发现肾透明细胞癌潜在治疗靶点
为进一步调查这些调控因子对肿瘤细胞的影响，科研人员分别在肾细胞癌细胞系和异种移植小鼠肿瘤模型中分别敲低这几个转录因子，即下调转录因子表达水平后发现能够显著抑制肿瘤细胞的生长。
“我们将人源肿瘤细胞系注射到免疫缺陷小鼠的皮下后产生肿瘤，即为异种移植小鼠肿瘤模型，以模拟肿瘤细胞在体内的生长能力。”文甲明解释说。
同时，结合国际公开的小分子化合物扰动数据库LINCS10，科研人员筛选出了2个已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于疾病治疗的药物进行对照试验。
科研人员分别在两个鉴定出的肾细胞癌细胞系培养过程中，将筛选出来的药物按提前摸索好的浓度加入到细胞培养基中，作为药物处理组，同时在对照组中向培养基中加入与药物处理组等量体积二甲基亚枫，药物处理两天后，收集药物处理组和对照组细胞，检测HOXC5、ISL1和VENTX的转录水平。
经检测发现，药物处理组的HOXC5，ISL1和VENTX的转录水平明显低于对照组。基于此，科研人员将敲低了转录因子的肾细胞癌细胞系和对照组的肾细胞癌细胞系，同时以同样数量注射到免疫缺陷小鼠皮下，一段时间后，敲低转录因子组的皮下肿瘤明显小于对照组小鼠。科研人员即认为敲低转录因子能明显抑制肾细胞系细胞在体内的生长能力。
记者了解到，科研人员对经药物处理组、对照组的肾细胞癌细胞，检测细胞增殖能力，发现药物处理组与对照组相比，肾细胞癌细胞体外增殖速度明显减慢。
此外，科研人员刻画了对各个免疫细胞亚群的转录程序和表观特征，并在肿瘤细胞和免疫细胞亚群间识别出了多对具有潜在临床意义的配体-受体互作对。
“本次研究描绘了肾透明细胞癌的单细胞转录组和表观基因组图谱，识别了肿瘤细胞特异的基因转录和表观调控程序，可为设计更有效的治疗策略提供新的线索。”文甲明表示。