生物分析专栏 | 单克隆抗体药物的药代动力学和生物分析

转自：阳光诺和

生物技术药物的发展始于1982年，FDA批准第一个基因重组药物——胰岛素Humulin上市，这是生物技术药物发展的元年，是药物从化学合成或者中药提取走向通过生物技术手段获得的标志性事件。1986年，第一个治疗性单克隆抗体药物OrthocloneOKT3获批上市，拉开了单克隆抗体药物发展的序幕。随后，从1997年嵌合型抗体美罗华出现，到2002年实现全人源化的修美乐获批上市，以及接下来不到20年的时间里，ADC、双特异性抗体、单域抗体等相继获批，众多新的治疗策略从科学概念逐步走向临床。目前，美国FDA累计批准上市了94个单抗类药物（截止至2020年7月），几乎占据生物技术药物的半壁江山。

不同于小分子化学药物，单抗药物是基于疾病相关靶点及其信号通路进行设计。可通过非共价作用与靶点发生可逆的、高亲和性的结合，引起阻断或激活作用进而调控下游生物学效应而产生药效或/和副作用。相比小分子药物，单抗具有靶点选择性高、特异性强、临床疗效确切等特点，适应症涉及肿瘤、免疫系统相关疾病、神经系统相关疾病、眼科疾病、罕见病等。在单抗药物的开发过程中，了解单抗靶点介导的药代动力学特点，获得体内靶点及药物浓度水平，对于深入理解药物与靶点相互作用对PD指标或/和临床终点的影响、评价潜在的生物标志物、阐明量效关系、探究PK/PD相关性等意义非凡。本文将从靶点的类型、单抗的药代动力学特点、单抗药代的影响因素及单抗的生物分析几个方面进行阐述。

01

靶点类型

生物靶点为能够与药物分子结合并产生药理效应的生物大分子。这些靶点存在于机体靶器官细胞膜上或体液内，主要有受体、配体、酶、离子通道和核酸。

受体多为糖蛋白，一般至少包括两个功能区域，即与配体结合的区域和产生效应的区域。受体通过识别和选择性结合配体（Ligand）（信号分子），改变构象而产生活性，启动一系列过程，最终表现为生物学效应。受体有细胞膜受体如离子通道偶联受体、G-蛋白偶联受体；细胞内受体如细胞浆受体和细胞核受体。配体是能与受体产生特异性结合的生物活性分子，包括体内的生物活性物质（如激素、神经递质、细胞因子、信息分子）以及外源性的生物活性物质如药物。

靶点的分布和调控关乎治疗的精准性和疗效。许多配体和受体都参与了细胞的生长增殖，在某个生理部位或者疾病状态下靶点表达会发生变化，因此药物可以通过选择性地与受体结合，发挥激活或者阻断受体活性而达到治疗目的。单抗与靶点结合引起下游信号通路的变化和/或介导抗体依赖性细胞毒（ADCC）效应和补体依赖细胞毒作用（CDC）等效应功能。单抗药物能否发挥作用与靶点的类型有关，若受体表达在实体瘤上，药物发挥作用会受诸多因素影响，如由血管内皮至组织的渗透率、循环时间、内皮的通透性、静水压、内皮细胞上靶点的表达等等；而靶向可溶性靶点可以避免这个问题，但也面临其它挑战，如阻断该靶点是否影响正常生理功能或者产生毒副作用等。因此了解靶点的类型及特点，有助于我们更直观地理解靶点与药物相互作用方式，以及深刻认识靶点对药物的处置特性。

根据靶点存在的位置，可将其分为膜靶点（Membrane-boundtarget）和可溶性靶点（Solubleligand），如图1所示，下面将对其特点进行介绍。

1膜靶点

膜靶点即细胞表面的受体，存在于细胞膜表面，能与配体特异性结合产生生物学效应，如EGFR、HER2、PD-1、PDL-1和CTLA-4等。细胞膜表面的受体（简称膜受体）会根据细胞的功能状态发生变化以维持受体的动态平衡。膜受体会通过循环或降解途径持续内化。受体的内化是指受体蛋白通过质膜凹陷从而脱离细胞膜进入细胞质的过程，内化后受体失活，信号转导过程可能中断，也可能会进一步调控下游效应器。有些药物可以下调细胞表面的受体，通过降低受体的作用而增加疗效。持续给药可能会降低细胞表面靶点的净数量，从而影响疗效。如果药物的作用机制是ADCC或者CDC时，则希望抗原抗体复合物的内化作用较弱，以最大程度地招募免疫效应细胞或者补体而发挥作用。

膜结合蛋白的细胞外结构域（Extracellulardomains，ECD）会脱落进入循环系统即为可脱落靶点。同时以膜结合和可溶性两种形式在体内存在的靶点如：CD20、CD25、CD52、EGFR、HER2以及CTLA4。在一些肿瘤和炎症疾病中可观察到脱落受体水平的提高，并且会受到给药等因素的影响。循环中脱落靶点水平的升高会与疾病进程息息相关，如HER2。同时，膜靶点的受体占位（Receptoroccupancy,RO）也会受到可脱落靶点水平的影响。脱落的受体可能会因为占据了药物的结合位点，使药物与膜靶点结合的可能性降低，从而降低药物的疗效。还有些受体会分泌调节不表达该受体的细胞的相关功能，如IL-6和可溶性IL6-Rα复合物会通过信号转导的作用机制，与β-受体gp130结合刺激不表达IL6-Rα的细胞。通常，可溶性靶点和可脱落靶点不会作为直接的靶点募集的生物标志物，某些情况下会用来预测疾病。通过检测循环系统中的受体水平有助于我们了解疾病的表现及其发展进程。此外，不同的人细胞膜脱落靶点的程度也各不相同。

2可溶性靶点

可溶性配体可以通过与循环系统中的药物结合发挥作用。通常情况下，循环中的可溶性靶点或者可脱落靶点含量非常低，含量从pg/mL到ng/mL。可溶性靶点会通过快速更新（包括：快速清除，快速产生）维持体内较低的基线水平。可溶性靶点的表达水平与疾病密切相关。总靶点水平会在疾病状态下上调；给药后，由于与药物结合，清除率降低，也会提高靶点水平。常见的可溶性配体如TNFα（也存在膜结合形式）、VEGF、BLyS、IL-1β、IL-12/IL-23、RANKL、IgE、IL-6（也存在膜结合形式）等。

02

单抗的药代动力学特点

单克隆抗体药物是由抗原结合域（Fab）和可结晶区域（Fc）组成，Fab段由轻链和部分重链构成，主要特异性识别相关抗原，进而调控下游信号通路；Fc段则由剩余的重链部分构成，可识别并结合表达Fc受体的免疫细胞(如自然杀伤细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)以及补体，以激活相应的免疫应答，介导抗体依赖性细胞毒作用（ADCC）、抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）以及补体依赖细胞毒作用（CDC）等效应，单抗的结构如图2所示。目前获批的单抗主要都是IgG亚型，IgG每条链包含恒定区（Constantregion，C区）和可变区（Variableregion，V区）。恒定区为靠近C端氨基酸序列相对恒定的结构域；可变区为轻链和重链靠近N端的氨基酸序列变化较大的结构域，可变区决定抗体的抗原特异性。VH和VL各有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，这些区域称为高变区(Hypervariableregion，HVR)，该区域形成的与抗原表位互补的空间构象，被称为互补决定区（Complementarydeterminingregion，CDR），与可变区的其它部分相比，CDR序列可变性更高。

药代动力学在小分子药物研发中起了极其关键的作用，单抗由于其分子质量较大（达150kDa），具有亲水性、可变的溶解度、膜通透性较差等理化特性，使其呈现出不同于小分子药物的独特的药代特征，如：口服吸收差、皮下/肌肉注射时的淋巴转运、有限的肾排泄、FcγR/FcRn受体介导的体内循环、靶点介导的药物处置等。下面将介绍单抗的吸收、分布、消除以及药代动力学模型。

1吸收

单抗分子量大、极性较强、具有较低的分配系数和扩散性能、使其不易为亲脂性生物膜摄取，故很难通过胃肠道进行吸收。同时，存在于胃肠道大量的酶会对药物产生降解作用。胃肠粘膜的低通透性和高酶活性这两方面的屏障作用使其生物利用度十分有限（小于1-2%），绝大多数口服后不能产生足够的药效浓度。因此，单抗的给药方式通常采用静脉注射给药方式、皮下或肌肉注射给药。皮下或肌肉注射给药生物利用度较高，一般在52%-80%范围。

通常，分子量<16kDa的药物可通过毛细血管进入体循环系统，而目前认为皮下或肌肉注射的分子量较大的单抗，主要是在淋巴系统中以对流转运的方式进行吸收（如图3所示），极少部分通过新生儿受体（theNeonatalFcreceptor，FcRn）吸收。淋巴系统具多孔性，孔道的截留分子量是单抗分子量的100倍，使得相对分子质量较大的单抗能够在细胞间液对流作用下进行转运吸收。在淋巴系统中，单抗可被单向运输至静脉系统。正常生理情况下，淋巴流动速度较慢（15mL/天），使得皮下注射给药需要长至数小时甚至数天时间才能被吸收，mAb的达峰时间为1.7-13.5d，大多是6-8d达到峰浓度。许多因素都会影响皮下注射时单抗的吸收过程，如注射部位，药物因素如电荷、分子大小、糖基化、制剂类型以及给药剂量等；还与人的体重、性别、年龄、活动水平、疾病状态、呼吸速率以及血压息息相关；种属间淋巴组成的差异还会使药物的吸收存在种属差异。

2分布

对于传统小分子药物而言，为了明确可能的毒性代谢产物在组织内的积累，研究药物在全身的分布必不可少。但是，对于单抗药物，其分解代谢的产物为氨基酸，可在内源性氨基酸库中循环再利用，因此，单抗的分布研究主要是用来评价药物对特异组织的靶向作用，以及鉴别主要的消除器官。

单抗的分布依赖于组织内的渗透率和在组织间隙的分布能力、在细胞表面受体的结合水平、以及从组织清除（包括细胞内摄取和降解）的能力。单抗的渗透（extravasation）主要通过三个过程：被动扩散、对流转运和上皮细胞的胞吞作用。靶点和药物的亲和力常数约为1nM，而一般单抗血药浓度超过10nM可以起效。主要受限于单抗的理化特性和分子大小，导致其难以通过扩散的方式分布进入组织。单抗通过被动扩散跨过细胞膜的比例较小，而主要是通过细胞旁路转运或者跨细胞转运分布到外周组织。对流转运是在血液-组织静水压梯度驱动下，药物通过血管内皮细胞之间的空隙进入组织间隙或者经由淋巴系统从间质间隙转运至血液。对流属于细胞旁路途径，被认为是单抗由血液转运至组织的主要方式，由从血管到组织的体液流量决定。跨细胞转运途径主要是通过胞吞作用实现的。胞吞作用包括受体介导的内摄作用（如Fcγ受体、FcRn）以及非受体介导的吞噬作用和胞饮作用。由Fc受体介导通过血管上皮细胞的胞吞作用，可能是单抗另一种重要的转运途径。尤其在组织中，通过对流作用跨膜受限时，该途径尤为重要。许多研究表明，该途径具有双向转运特性，如进入内皮细胞的抗体在FcRn的作用下，既可以被转运到组织间隙，也可以被重新转运回血管中。单抗的组织分布如图4所示。

a.通过胞饮摄取进入细胞或者通过FcRn介导回到血液或者转运至组织间隙；b.药物通过在血管内皮细胞旁路的对流转运进入组织间隙，然后通过淋巴液的对流转运从组织中消除；c.与靶点抗原结合。

在组织间隙和细胞表面，单抗可依靠对流与靶点结合进行分布。可见，靶点在血中的单抗，其组织分布会受到限制。单抗从组织间隙清除依赖于单抗进入淋巴的对流速率。这个过程与从血管至组织间隙的过程一样，依赖于梯度差、液体流速（淋巴流速）等。由于淋巴具有相对大的孔径，单抗从组织间隙到淋巴的过程比从血液渗透至组织间隙时遇到的阻力要小。通常，组织间隙中未结合的单抗浓度低于血中浓度。

药物在组织中的分布常用表观分布容积（Vss）来表示。Vss为体内药物总量平衡后，按血药浓度计算所需体液总体积，是通过稳态时体内药物总量与血药浓度的比值进行计算的。药物在组织中的量是由组织间隙液中的药物和结合在细胞上或者内化至细胞内的量决定的。对那些可以与细胞膜受体结合的药物，药物主要则集中在组织中，Vss按理应该非常大。与此相反，大多报道表明这类药物的Vss仅相当于血液的体积（哺乳动物60-80mL/kg）。主要可能由于采用了非房室模型或者房室模型（如二室模型）进行计算导致的。同时，由于药物与靶点结合有限而呈现非线性分布，Vss会随着剂量或者稳态血药浓度的增加而减小。此外，IgG的组织分布还会受限于细胞间的基质组成。细胞间隙基质具有凝胶样粘度，并且具有净负电荷，组成有粘多糖（如玻尿酸）和胶原蛋白，它们会与IgG分子存在相互排斥作用。

3消除

抗体通过排泄或分解代谢的方式进行消除。肾脏主要分解代谢分子量低于60kDa的物质，所以完整的抗体难以通过肾脏进行过滤消除。和免疫球蛋白一样，单抗主要也是通过分解代谢的方式进行消除，得到的肽段和氨基酸可参与内源性蛋白质的合成。Fab和Fv可以通过肾小球过滤、肾小管重新吸收或代谢。单抗药物可在细胞内被溶酶体或/和蛋白酶降解成肽段和氨基酸，或者通过与抗原形成免疫复合物被免疫系统清除。单抗的消除方式有：非特异性的细胞吞噬作用、非特异性的Fc受体介导的消除和特异性的靶点介导的消除。

非特异性的细胞吞噬作用

胞饮是内皮细胞在液相环境下，对抗体产生非特异性的内吞作用。体内内皮细胞表面积大于1000m2，其可有效地从体内清除IgG。通过胞饮摄取作用分解代谢IgG并非局限于某个器官，而是全身都会发生。尤其是发生在那些内皮细胞的毛细血管床内。皮肤、肌肉和胃肠道是IgG的主要消除途径。

非特异性的Fc受体介导的消除

抗体的Fc可与Fcγ受体（FcγRs）结合内吞进入细胞或者通过ADCC作用被清除，Fc还可以通过与补体C1q（CH2）结合介导CDC作用清除药物，该途径具有较大的清除能力，会使药物呈现线性药代特点。

FcγRs通常表达于内皮、肌肉、肝等组织的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等各种免疫细胞表面，有FcγRⅠ，Ⅱ和Ⅲ三种亚型，可识别生物分子Fc区域（CH1和CH2）。通过与FcγRs结合激活细胞的內吞与水解作用，从而介导生理性抗体的消除。Fc受体不仅可介导生理性IgG的消除，也可以介导具有Fc的外源性治疗性蛋白的消除。利用FcγRs敲除的动物研究表明，对大部分单抗，FcγRs介导的清除所发挥的作用较小。可能由于血中存在大量的生理IgG会增加与相对含量低的单抗药物竞争结合FcγRs的机会，从而削弱了药物与受体的结合作用，使得FcγRs对单抗的PK影响并不明显。大部分单抗可通过形成可溶性的免疫复合物，通过其效应功能发挥药效作用（如ADCC）的同时，免疫复合物会增加与FcγRs的结合能力，此时，通过FcγRs的受体介导内吞作用可能会对单抗整体的消除有额外的贡献。

为了维持体内IgG的平衡以发挥其生理作用，FcRn对IgG的保护机制较为重要，如图5所示，该作用与Fcγ受体作用相反。FcRn在内皮细胞，髓样抗原呈递细胞（APCs、单核细胞、巨噬细胞和一些树突细胞）、成年人的肠道、血脑屏障、肝、肾等均有表达。FcRn具有重要的生理调节功能，在维持血清中IgG的水平中发挥重要作用。研究表明，FcRn受体与IgG的Fc区域（CH2和CH3）结合后，能够避免被细胞内的溶酶体降解。这种结合依赖于酸性环境，生理pH环境下，FcRn与IgG的亲和力较低。药物通过血管内皮细胞或/和循环系统中单核细胞的内吞作用（胞饮或者受体介导的内吞）使血中的IgG与FcRn结合，通过形成核内体进入细胞。核内体的酸性环境使得IgG与FcRn的亲和力增加。一旦结合，FcRn-IgG复合物会被转移至细胞表面，在生理pH环境下，释放IgG回到血液循环系统中。核内体中未结合的IgG则会被溶酶体中的蛋白酶降解。IgG单抗药物及其抗原抗体复合物也同样会因为FcRn的保护作用而延长体内的消除半衰期。该保护作用使得IgG1、IgG2和IgG4的消除半衰期长达18-21天。IgG3与FcRn的亲和力较低，所以半衰期仅为7天。有研究表明，鼠敲除FcRn后，IgG的清除增加10倍。IgG与FcRn相互作用一般认为是由Fc决定的，但有研究发现，Fab臂构象的变化会影响FcRn的结合。此外，IgGs的Fv电荷的分布也会影响与FcRn的结合能力。在眼部和脑组织FcRn介导的清除作用机制不明。

尽管存在FcRn的保护作用，但是由于生理IgG浓度达12mg/mL，使得FcRn的再循环过程饱和，会削弱该作用。当IgG的浓度增加，无论是给予高剂量的外源性免疫球蛋白，还是内源性变化如多发性骨髓瘤，IgG的清除率都会增加，半衰期降低。相反，低丙球蛋白血症患者则会降低单抗的清除，延长半衰期。然而，由于大部分的单抗临床给药剂量低于10mg/kg，仅占人体内IgG总量的1-2%，所以FcRn对IgG的再利用作用一般在给予治疗剂量的单抗时不产生明显改变。此外，药物与人体的FcRn结合时，非人源抗体较人源化抗体的亲和力低，随着人源化程度的增加单抗的半衰期显著地延长，半衰期由小到大依次为：鼠源性<嵌合型<人源化<完全人源化。由于FcRn与人IgG的亲和力存在种属差异，选择动物模型时需要注意。人IgG1与鼠FcRn的结合能力是与人FcRn结合能力的2.5倍，所以在鼠模型上评价人IgG1的FcRn介导的吸收和分布过程时会高估该作用；而人IgG与食蟹猴的FcRn的结合能力与人相似。

特异性的靶点介导的消除

单抗具有靶点介导的药物消除（Target-mediateddrugdisposition,TMDD）特征，可特异地与细胞表面的靶点/抗原结合，通过内化作用进行消除。细胞对药物内吞后，可触发细胞内溶酶体对单抗-受体复合物的降解。由于细胞表面靶点的数目有限，该途径易饱和，不仅与药物的剂量有关，还与靶受体的生物学特性，如亲和力、表达水平（上调/下调）、内化率及更新速率有关。该途径的作用程度取决于单抗的暴露量和靶点水平之间的关系，见图6。当药物的暴露量远小于靶点量时，该消除途径未达饱和，总体呈现为线性药动学特征。随着药物浓度逐渐增加至大于靶点量时，该消除途径则开始饱和，清除率随着剂量的增大而降低，呈现出非线性特征。但当进一步增加药物的暴露量时，靶点介导的消除作用将远小于Fc介导的非特异性消除作用，消除呈现一级动力学特征，清除率降低，药时曲线表现为达到平台，总体呈现为线性药代。若体现在给药剂量上，低剂量时，靶点介导的消除途径呈现非线性PK，随着剂量的增加，清除率逐渐降低；随着靶点的饱和，靶点介导的清除对药物的整体清除率的贡献有限，甚至可忽略不计，PK又呈现线性。通过单次静脉给予药效相关动物受试药物递增剂量，从清除率或者半衰期与剂量的变化数据可以轻易地判断药物是否具有TMDD特征。

图6 药物TMDD的C-T曲线[JournalofPharmacokinetics&Pharmacodynamics,2012]

(A)药物与靶点快速成成平衡;(B)靶点处于饱和状态，药物主要通过异化作用消除，该过程是一级动力学过程，所以总体呈现线性PK;(C)靶点饱和状态逐步减弱，此时靶点介导药物处置的这个消除途径越来越明显，呈现非线性PK;(D)药物浓度进一步降低，靶点远未达饱和，靶点介导的消除和异化作用都为一级动力学过程，总体又呈现为线性PK。

TMDD一般多见于作用于膜受体的单抗，作用于可溶性配体的单抗也会表现TMDD特征。另外，由于种属差异，动物的药效靶点常比人体内的活性差，而且一些药效靶标在患者体内一般比健康人更多，因此临床患者更易发生非线性PK。但通常临床研究给药剂量下，TMDD消除途径饱和使得药物大都呈现线性特点。单抗的体内过程如图7所示。

4药代动力学模型

非房室和房室模型

单抗的药代动力学模型大都采用房室模型和非房室模型进行拟合，尤其以经典的二房室模型的应用居多。房室模型理论中假设药物在各房室间的转运速率以及药物从中央室中消除的速率均遵循一级反应动力学，因此动力学过程属于线性动力学。房室模型和非房室模型的假设前提是线性PK，并且药物在血浆和组织间可快速达到平衡，而单抗与靶点具有特异性的亲和性，呈现非线性动力学特征，实际中，采用非房室模型或者简单的房室模型拟合会低估Vss。

TMDD模型

TMDD模型用于描述单抗与靶点结合以单抗-靶点复合物的形式进行消除的特性。该模型需要结合药物与靶点的结合和解离常数进行描述。虽然TMDD有助于了解药物与靶点之间的相互作用机制，但实际中应用较少，除了因为可能缺少靶点和/或药物靶点复合物浓度的数据，为了识别非线性特点PK数据还需要跨越较大的浓度范围使实验难度增加。由于药物靶点结合速率远大于解离速率，加上实际中剂量的选择、采血点的选取，以及可能存在的免疫原性等因素的影响，使得TMDD模型拟合的数据可能有偏差。可以采用快速结合假设（RB）、准稳态假设（QSS）和米氏假设对TMDD模型进行简化，以提高该模型的稳定性。

生理PBPK模型

PBPK模型赋予了房室生理和解剖意义。单抗药物的PBPK模型可以同时描述血浆药物动力学特征、组织药物浓度与时间的关系，以及单抗药物特殊的处置方式，如TMDD、对流转运、FcRn介导的药物再利用，蛋白酶降解等。一个PBPK模型甚至会包含16个组织房室，每个房室还会进一步分为血管、核内体、细胞间质、细胞的房室，不同种属参数不同，不同组织不同系数，会涉及到药物与FcRn的结合和解离常数、未结合药物的降解速率、以及胞饮作用的清除速率等。PBPK模型极为复杂的建立过程限制了其应用。简化的PBPK模型的出现在一定程度上提高了其适用性。

PK/PD模型

不像小分子，通常，单抗存在TMDD，使其PK与PD具有较好的相关性。PK/PD模型有助于预测药物在人体的安全性和有效性，有助于了解抗体和靶点的相互作用机制，有助于理解潜在的生物学功能和疾病发展进程间的关系。已有许多研究基于单抗不同的应用建立相应的PK/PD模型，如免疫毒性治疗、靶细胞消除、改变细胞功能及靶向药物等。根据靶点对药物的处置特点以及药物与靶点的相互作用特点建立合适的PK/PD模型对于单抗药物的研发具有重要意义。

03

单抗药代的影响因素

1药物特性对PK的影响

电荷

蛋白所带电荷为零时的pH为等电点（Isoeletricpoint，PI），此时蛋白质在电厂中的迁移率为零，可用来衡量蛋白的带电性。在与细胞表面的具有负电性的靶点相互作用时，单抗的带电性会影响PK。一般说来，单抗的PI越高，偏碱性，表现出易与细胞表面的负电性位点相结合，则组织摄取率增加，清除率加快；相反，PI越低，偏酸性，由于细胞表面结合位点负电性的互斥作用，使得细胞摄取较低，表现出组织摄取和血中清除率的降低。研究发现，药物的PI值改变至少1个单位时才对其PK和组织分布产生影响，若改变不足1，一般不会影响PK。同时，通过PI的改变可以优化药物的PK特性，尤其对于那些具有较强的靶点介导清除特征的药物，可通过降低药物的PI，降低药物的清除，延长半衰期。

糖基化类型

和天然IgG一样，目前获批的单抗大部分都具有糖基化位点（CH2，Asn297），有的药物Fab区还会有糖基化位点。位于CH2区域Asn297上糖基化侧链在调控单抗与C1q和FcγRs的结合作用中起着关键的作用。在抗体介导的CDC效应功能中，通过Fc与补体C1q结合启动补体级联反应致使靶细胞裂解；在抗体介导的ADCC效应功能中，抗体的Fc与效应细胞上的FcγRs结合引起单核细胞、巨噬细胞或者NK细胞对靶细胞的杀伤作用。

不同的糖基化类型对PK和PD会有不同的影响，比如通过糖基化的改变可增加药物与FcγRIIIa的结合以增强ADCC效应，增加了杀伤靶细胞的同时加快了药物的消除。有研究还发现，糖基化侧链上无半乳糖结构的IgG2和IgG1（可能）在体循环中的半衰期会较其它形式的长20-40%，可能的原因是半乳糖基化形式与FcγRI的亲和力更高。

2可溶性/可脱落靶点对PK的影响

可溶性靶点

体内靶点水平的高低会使单抗的PK呈现不同的特点，作用于可溶性靶点的单抗的PK特点如表1所示。

单抗直接作用于体内水平较低的可溶性配体时，如：TNFα、干扰素-α、VEGF和IL-5，会表现出线性消除的特点。免疫复合物通过FcγRs清除会呈现非特异性、线性消除的特点。在大多数情况下，游离的可溶性配体的清除过程较免疫复合物快。可溶性靶点与单抗药物结合后，由于可溶性配体会遵循单抗的分布和清除规律，同时，药物可能会阻碍可溶性配体正常的消除过程使其在循环系统中积累，所以血浆中总靶点水平会显著升高；同时，药物的结合使可溶性靶点水平降低，这种负反馈机制也可使机体增加对这些靶点的合成。此外，作用于低水平可溶性靶点单抗药物的PK不会因为患者靶点水平的上调而发生变化。

单抗作用于体内水平较高的靶点时，如IgE、RANKL（Receptoractivatorofnuclearfactorkappa-Bligand），药物呈非线性动力学特征，并且药物与配体结合后会表现出更快的清除免疫复合物的现象。可能的原因有：对于像TNF和TGF超家族的细胞因子等这些天然的二聚体或者三聚体游离配体，可组成多个重复的表位结合多个药物；并且更易于聚集，可以与药物形成超大免疫复合物，进而增强FcγRs介导的免疫反应，如ADCC效应、吞噬作用以及炎症反应，通过细胞吞噬的作用快速地清除药物。

表1靶向内源性可溶性配体的单抗的PK特点[ExpertReviewofClinicalPharmacology,2016]

可脱落靶点

相比于与血管外的膜靶点结合，单抗更易与脱落的靶点结合聚集在血管区域，作用于可脱落靶点的单抗的PK呈现非线性，如表2所示。非线性PK可能是TMDD或时间依赖的消除机制引起的。药物同时提高可溶性配体和细胞表面受体的水平时，可能会导致TMDD。时间依赖性消除与靶点的耗竭（depletion）或者靶点表达水平随时间变化有关。循环中脱落的靶点可与药物结合形成免疫复合物，可以加速免疫复合物清除的同时，还会干扰药物与细胞表面受体的结合，从而影响药物的疗效。此外，脱落抗原水平、药物与脱落靶点和膜靶点的相对结合动力学的差异会影响膜靶点的RO。可见，脱落靶点对药物PK和PD均有影响。

表2靶向膜结合可脱落靶点单抗的PK特点[ExpertReviewofClinicalPharmacology,2016]

3患者因素对PK的影响

患者的基因多态性、疾病状态等均会对药物PK产生影响。例如患者的FcRn异源二聚体的表达差异会对单抗的药代有影响。常见的VNTR3/VNTR3基因型对FcRn的转录水平是VNTR3/VNTR2的1.66倍，使得infliximab在杂合子肠炎患者体内比纯合子患者体内的暴露低。另外，FcγR也存在基因多态性。乳腺癌患者HER2过表达的患者会存在FcγRIIIa的158位置的苯丙氨酸（F）变成缬氨酸（V）的情况，而氨基酸的变化增强了IgG1与FcγR的亲和力，同时增强了ADCC作用。临床上，V/V基因型的患者对药物表现出更高的应答率。FcγR的基因多态性会影响以ADCC作用为主要消除途径时药物的清除率，如FcγRIIIa为F/F基因型的患者，infliximab体内清除率会降低。

患者的疾病状态也会影响药物的药代。蛋白的分解代谢是单抗的主要消除方式，它会受各种疾病状态影响，如癌症、损伤、慢性炎症等。体重减轻、体型消瘦等癌症相关症状是慢性炎性反应的表现。癌症患者相比正常人，炎症水平的提高会使整体蛋白周转率提高50-70%，这不仅会影响内源性蛋白的代谢，还会影响外源物的代谢。结果表现为，患者间的非特异性的蛋白清除各不相同。蛋白周转率的增加，如低白蛋白血症，会导致IgG分解代谢增加，清除率增加，降低药物的系统暴露。C反应蛋白（CRP）是系统炎症水平升高的一个非特异性指标，它在单抗的清除中也较为重要，CRP的体内水平与单抗的清除率正相关。此外，有些肿瘤患者内源性蛋白的周转具有时间依赖性，可能由于系统炎性水平的降低，药物清除率降低，提供了患者对药物的应答。

4免疫原性对PK的影响

单抗进入机体后可能诱导免疫应答，以进入体内的抗体作为抗原生成第二抗体，即抗药抗体（ADA）。ADA的生成可能会加快药物的消除速率。免疫原性与抗体的人源化程度、给药方式、给药剂量、给药频次、治疗时间的长短有关。随着人源化程度的增加，抗体药物免疫原反应发生概率逐渐减少，但即使是全人源化的单抗也会引起免疫原性；免疫原性的发生率为皮下注射＞肌肉注射＞静脉，低剂量、多次、长期给药易产生免疫原性。此外，免疫原性还与患者的疾病状态有关。

具有中和活性的ADA会影响抗原-抗体结合，在临床上会降低药物发挥作用，还可能会引起副作用。无论是非中和活性还是中和活性的ADA均可能会对药物的PK和系统暴露产生影响。对PK产生的影响通常表现为药物清除率增加，药物的系统暴露降低或者变化甚微。清除率增加的原因可能是由于大小和结构上各不相同的ADA-单抗复合物的形成，触发了网状内皮组织中溶酶体对免疫复合物的摄取和降解，免疫复合物的消除或快或慢于药物单独存在时的消除速率。

5脱靶效应对PK的影响

为了避免自身免疫性疾病，通过体细胞突变而成熟的抗体会严格控制清除体内不利的突变体，这些突变体会非特异性地与自身抗原结合或广泛地与正常组织发生相互作用。尽管单抗的设计是针对抗原的，然而，体外筛选或者成熟的抗体缺乏体内类似的控制系统，会筛选出一些非特异结合的突变体，对非相关抗原具有多特异结合能力。单抗的脱靶效应会明显影响PK、组织分布、药效以及毒性。可能会加速药物的清除而降低疗效或者非靶向结合而引起毒性。

04

生物分析

获批单抗主要为IgG类型，IgG具有两个抗原结合价。给予人或动物单抗药物后，它可以与循环中的靶蛋白、抗药抗体以及其它的内源性物质相结合。二价抗体药物在体内有多种可能的存在形式：游离型抗体（mAbfree）、部分游离型抗体（PartialfreemAb）、结合型抗体(mAbbound)，三者之和为总抗体（mAbtotal）。游离型抗体是二价均未结合配体，也有将游离型抗体定义为二价均未结合和单价结合配体的总和；部分游离型是只有单价结合了配体；结合型抗体是二价均与配体相结合；总抗体则是游离型抗体和结合型抗体的总和（mAbfree+mAbbound）。大多数情况下，由于游离型抗体和部分游离型抗体仍存在与靶点结合的能力，所以被认为是可发挥药效作用的活性形式，两者共存时会与药物的体内暴露、靶点募集（Targetengagement）和生物学效应相关联。总药物浓度可以提供药物和靶点的相互作用信息。上述药物形式的体内水平会因为PD、免疫原性以及疾病状态而随着时间而变化。所以所选择的平台和方法的选择性、专属性等尤为重要。

根据不同的实验设计、试剂的选择以及不同的实验条件，可以采用配体结合法（LBA）测定上述单抗药物的不同形式，如图8所示。LBA法具有特异性高、通量高、灵敏度高等优势，应用广泛，据统计，临床95%的生物技术药物的PK研究采用的都是LBA法。

表3LBA方法验证指标

标准曲线

选择性

特异性

残留

精密度准确度

稀释线性和钩状效应

平行性

稳定性

LC-MS方法作为LBA法的补充（如图9），在单抗PK研究中的应用逐渐引起业内的关注，尤其临床联用药物时，试剂不易获得时，LC-MS可以用于同时定量不同药物的浓度。此外，研究靶部位药物暴露时，由于基质复杂，需要优化剧烈的样品制备方法释放药物时，LC-MS较强的专属性和抗干扰能力可以实现靶部位药物的准确定量。平台的选择关乎结果的可靠性。一般来说检测游离型药物浓度首选LBA法，如果需要检测药物的总浓度，可以根据试剂的准备等因素选择LBA或者LC-MS。靶点的干扰在分析检测中不容忽视，无脱落的膜结合靶点干扰单抗药物定量的情况少有出现，而对于那些循环中具有高水平的靶点存在时，则会干扰LBA法检测的药物浓度。尤其对于游离型抗体和部分游离型抗体的检测影响更大。但实际临床给药剂量达到摩尔级别时，可能对药物定量的影响甚微。

表4 色谱法方法验证指标

标准曲线

基质效应

选择性和特异性

残留

精密度准确度

定量下限

提取回收率

稀释可靠性

分析批容量

稳定性

处理后重进样重现性

05

结语

在过去的20年里，单抗药物的研发取得了史无前例的巨大成就。随着新型抗体药物的不断出现，需要对单抗的处置特点和代谢机制进行深入研究，以更好地应用于药物设计、指导临床用药，加快单抗药物的研发进程。

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