“给点近红外光就捣蛋”——合成生物学赋能细菌
“特洛伊木马”，细菌溶瘤有绝招
恶性实体肿瘤中分布着复杂的脉管系统，就像“占山为王”的“土匪”，依赖新生血管源源不断地掠夺给养，这为实体肿瘤的后续生长及转移提供了物质基础和必要条件。实体肿瘤中的血管大多走形扭曲，血液流通不畅，这导致了大部分药物分子很难深入实体瘤内部，从而大大削弱了药物分子的抗癌作用。以目前比较有代表性的嵌合抗原受体T细胞疗法（ChimericAntigenReceptorT-CellTherapy,CAR-T）为例，其在白血病等血液肿瘤中表现出不错的治疗效果，但在恶性实体瘤中的表现却不尽人意。因此，缺氧和免疫抑制的肿瘤微环境成为了诸多癌症治疗方法的最大障碍之一。
但对于细菌来说，这恰恰是个好消息。由于血液流通不畅导致实体瘤内环境缺氧，从而形成中心厌氧区，氧气浓度恰恰成为了细菌感知及靶向肿瘤微环境的重要信号之一，这为细菌的潜入、定殖提供了极大的生存空间。例如大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌等兼性或专性厌氧菌等都具备着较高的肿瘤定殖能力。
大量小鼠实验的研究也表明，通过静脉注射的方式将细菌注入小鼠体内，正常组织内的细菌会随着小鼠机体免疫系统的激活而被消灭，而进入肿瘤内的细菌却能定殖下来，建立自己的“根据地”，不仅躲避掉了免疫细胞的围追堵截，还能像“特洛伊木马”一样，潜入肿瘤内部，作为治疗载体释放药物，为消灭肿瘤细胞奠定了基础。虽然这些策略提高了小鼠的肿瘤治疗效果，但在临床研究中的情况却大不相同。例如，细菌载体释放的药物多为化学药物或细胞毒蛋白，这就导致了细菌的治疗效果是剂量依赖性的。因此，需要更高的定殖率才能实现更好的治疗效果。但由于临床中肿瘤异质性更大、细菌定殖密度低，同时细菌的定殖是动态且不可控的，这对细菌疗法向临床推广造成了更大的阻碍。因此，对于肿瘤治疗这样一个长期的干预过程，如何改造细菌实现治疗药物时空可控和持续释放到肿瘤微环境中，成为了突破细菌疗法治疗瓶颈的关键。
近日，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所金帆课题组，在国际学术期刊国家科学评论（NationalScienceReview）上发表了题为Programmingthelifestylesofengineeredbacteriaforcancertherapy的研究成果。该研究设计开发了一种可通过层级性调控近红外光强度编程细菌生活方式来控制细菌的粘附、定殖以及药物释放的工程化铜绿假单胞菌株，实现了对肿瘤细菌疗法中细菌定殖以及药物释放过程的持续精确控制，具有潜在应用价值。
打造“细菌变形金刚”，光控细菌“浮游-定殖-裂解”三态切换
在自然界中，铜绿假单胞菌在有利的环境下处于浮游状态，其在表面定殖的能力较弱；而在不利的环境中则会进入生物被膜状态，其表面定殖能力大大增强。受到自然界中细菌生存方式的启发，研究团队为工程菌设计了浮游状态和生物被膜状态以实现对其定殖能力的控制，其中浮游状态细菌的定殖能力较弱，能够减少对正常组织的伤害；而生物被膜状态细菌的定殖能力较强，能够增加其在肿瘤组织内的定殖量。研究团队通过敲除毒力因子调控蛋白编码基因vfr和三型分泌系统相关基因exoS和exoT构建了减毒的铜绿假单胞菌菌株作为肿瘤细菌疗法中的新型底盘菌株。
铜绿假单胞菌在浮游状态和生物被膜状态两种生活方式之间的切换与细菌内参与调控生物被膜形成的第二信使分子环二鸟苷酸（c-di-GMP）的浓度密切相关。细菌胞内的c-di-GMP浓度高，细菌进入生物被膜状态；细菌胞内的c-di-GMP浓度低，细菌则进入浮游状态。
为此，研究团队通过设计两个基因模块来实现对细菌胞内c-di-GMP浓度的控制，分别是：
（1）通过组成型启动子表达磷酸二酯酶PA2133来分解c-di-GMP，使细菌维持较低的胞内c-di-GMP水平，从而进入浮游状态；
（2）引入可在近红外光照射下合成c-di-GMP的光敏蛋白BphS，近红外光照射可促进BphS表达，从而提高细菌胞内c-di-GMP水平，细菌进入生物被膜状态。
此外，为了实现治疗药物的控制释放，研究团队为工程菌设计了第三种生活方式，即裂解状态，通过c-di-GMP响应型启动子表达裂解基因，可使细菌在c-di-GMP升高后进入裂解状态（图1）。这样，细菌的三种生活方式便均与c-di-GMP的浓度相关。
虽然通过合成生物学基因模块的设计，实现了将c-di-GMP的浓度变化与细菌的三种生活方式偶联在了一起，但是如何才能通过控制近红外光照射强度，来精准调控细菌生活方式的变化呢？为了厘清细菌生活方式与各关键基因元件之间的关系，团队对不同光照强度下细菌的生活方式进行了理论模拟。结果表明，影响细菌浮游状态的磷酸二酯酶PA2133上游的核糖体结合位点（RBS1）与抑制细菌裂解的抗终止蛋白Q上游的核糖体结合位点（RBS2）的强度会对细菌的生活方式产生巨大的影响。
为了获得能够在不同强度的近红外光照射下呈现三种生活方式的工程菌，研究团队对上述的核糖体结合位点RBS1和RBS2进行批量替换，并通过96孔光照装置对候选菌株进行批量筛选，随后利用显微镜进行验证，最终获得了近红外光精准调的的工程化菌株被命名为H017（图2）。通过层级性调控近红外光的照射强度可以编程H017的生活方式，当对H017施加中等强度-高强度循环的近红外光光照程序时，细菌将进入“生物被膜状态-裂解状态”生活方式循环。
“近红外光遥控器”，调控细菌时空给药，精准溶瘤
另外，研究团队将细菌裂解的触发基因Q连接在响应c-di-GMP的启动子PcdrA后，只有当细菌内c-di-GMP浓度累计到一定浓度时才能将激活裂解系统从而释放抗癌药物HlyE蛋白。同时，为了抑制细菌的特异性粘附，研究团队在系统中加入表达分解c-di-GMP的磷酸二酯酶基因PA2133，实现在避光条件下细菌无法在表面定殖（图1）。
为了验证工程菌的三种生活方式在肿瘤治疗中的作用，研究团队首先在微流控通道中进行了细菌-细胞共培养的体外实验（图3）。当对指定区域的细胞施加中等强度-高强度的光照程序时，H017先进入生物被膜状态并大量定殖在细胞表面，随后进入裂解状态释放治疗药物造成细胞坏死。综合对照组的结果，研究团队发现细菌生物被膜状态的药物累积过程与裂解状态的药物释放过程是H017杀伤肿瘤细胞的关键。
在体外实验初步验证了H107对肿瘤细胞具有杀伤效果之后，研究团队将其应用在小鼠模型中近一步探究了H107对近红外光照射的敏感度和肿瘤治疗效果（图4）。
结果显示：
（1）在瘤内注菌后，避光培养三天组的小鼠肿瘤内的细菌数量与对照组没有显著差异，表明进入浮游状态生活方式的细菌难以在肿瘤内定殖；
（2）中等光强照射三天组的小鼠肿瘤内的细菌数量显著增加，表明进入生物被膜状态生活方式的细菌在肿瘤组织内的定殖能力大大增强；
（3）中等光强照射两天高光强照射一天组的小鼠比中等光强照射三天组的小鼠细菌瘤内数量显著降低，且肿瘤组织切片中能够看出明显的坏死区域，表明细菌裂解后释放药物并杀伤了肿瘤细胞；
（4）中等光强照射两天高光强照射一天再中等光强照射两天组的小鼠细菌数量再次上升，这表明细菌在中等光强照射后，再次进入定殖生长状态。此外，在中等光强近红外光照射七天后，瘤内的工程菌仍然具有裂解能力，表明该基因线路具有较好的遗传稳定性。
综合以上结果可知，不同强度的近红外光照射能够使瘤内细菌进入对应的生活方式并实现预期的功能，而通过连续改变的光照程序能够实现对瘤内细菌生活方式的持续控制。
最后，研究团队探究能否通过编程工程菌生活方式增强其肿瘤治疗效果（图5）。当H017仅作为药物递送载体时，高强度的近红外光光照能够使H017裂解释放药物，完成肿瘤治疗。团队在20天的实验周期内，通过8次注菌，有效抑制了肿瘤生长。接下来，研究团队通过光照程序对细菌的生活方式进行控制，以实现对药物累积和药物释放的持续控制。结果显示，在对小鼠施加两个循环周期的近红外光光照程序（中等强度2天-高强度1天）后，小鼠肿瘤生长受到了抑制，而对照组无法抑制小鼠肿瘤生长。随后，研究团队进行了更长周期的实验，结果表明，所有小鼠的肿瘤生长均受到了抑制。值得关注的是，30%小鼠的肿瘤完全消失，而对照组小鼠的肿瘤则持续生长。以上结果表明，编程细菌生活方式在肿瘤的长期治疗过程中具有显著优势，能够在较少的注菌次数下获得更好的肿瘤抑制效果。
小小细菌，无限潜力，大大效益
综上，该研究团队开发了一种动态规划细菌生活方式（浮游、生物膜或裂解）的遗传基因回路，通过对近红外(NIR)光的照明功率密度(LPD)的分级调节，精确控制细菌在肿瘤治疗过程中的粘附、定植和药物释放过程。近红外技术的深入组织渗透为我们在体内对细菌遗传回路进行时空和无创控制提供了一种新方式。
此外，该研究结果表明通过改变近红外照明方案来规划细菌生活方式转变的过程，可以精确控制细菌治疗肿瘤过程中的多个关键步骤，精确操控治疗药物的释放，可以大大提高治疗效果。本项研究在合成生物学领域推动了理论创新和技术创新，具有一定的科学价值。
更为重要的是，本项研究开发的细菌肿瘤治疗方法将在未来能为癌症患者节约开支。
中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所助理研究员张荣荣为文章共同第一作者及共同通讯作者，金帆研究员为文章通讯作者。
该研究得到国家科技部重点研发计划、国家自然科学基因，中国科学院科研仪器设备研制项目、中国博士后科学基金，长安私人资本、深圳合成生物学创新研究院等多个项目的支持，并得到了合成生物重大科技基础设施大团队的大力协助。
来源：中国科学院深圳先进技术研究院