应用秘籍 | 渗透压是细胞冻存的关键指标
转自：蒲公英Ouryao
低温冻存通常使用独特的试剂和非常低的温度来保存活细胞和组织，保证其活力和结构完整。在生物工艺中有较多的应用，如细胞建库和细胞系的长期存储。该技术起源于19世纪后期，随着理论实践的发展，低温冻存操作指南不断优化迭代，获得了较大的发展和进步。其中渗透压是低温冻存操作中重要的工艺改进工具。
下面的海报将研究安达望(AdvancedInstruments)的冰点降低渗透压仪在细胞冻存工作流程中的应用。
渗透压用于细胞冻存
和复融最佳条件的优化
细胞冻存/复融工作流程的每一个步骤都需要培养介质，均需进行渗透压测试。快速有效的渗透压分析工具可用于质量控制检查，确保配制溶液是正确的，并符合其添加之前的规范要求，减少潜在的错误，并降低冻存/复融循环对细胞的破坏。渗透压也可以作为新冻存试剂开发工艺中的关键质量属性，确保细胞健康并减少潜在的细胞损伤或死亡。
细胞冻存配方
样品
仪器型号
N
平均值(mOsm)
StDev
Cryostor CS5
XT
180
1416.7
13.9
CryostorCS10
XT
180
2749.7
26.6
PrimeXVFreezIS
XT
180
2111.3
17.9
样品
%CoefVar
最小值(mOsm)
最大值(mOsm)
Cryostor CS5
1.0
1393
1464
CryostorCS10
1.0
2675
2818
PrimeXVFreezIS
0.9
2015
2163
细胞和基因治疗中常用细胞冻存试剂的渗透压。上表统计数据显示了冰点降低渗透压仪测试(n=180)不同冻存试剂的结果。尽管冻存剂的浓度很高，OsmoTECHXT渗透压测试显示出良好的重复性和可靠性。
冰点降低渗透压仪可用于
含抗冷冻成分的样品的测试吗?
答案是肯定的。安达望(AdvancedInstruments)最近完成了一项内部研究，使用冰点降低渗透压仪OsmoTECH® XT成功测试了不同市售的细胞冻存试剂的渗透压。
细胞渗透压耐受极限研究-文献证据
Fig.4通过C57BL/6鼠胚胎干细胞（ES细胞）的细胞质膜完整性来确定其渗透压耐受极限的平均值（±SEM）。室温下相同数量的ES细胞暴露在38，75，150，600，1200和4800mOsm（每个条件下的n=6）的培养环境中10min，以285mOsm的培养环境作为参照，质膜完整性通过流式细胞术分析细胞对碘化丙啶的排除性进行评估。图片中的阴影区域代表了80%细胞具有完整质膜的渗透压范围。与等渗参照溶液标记相同的数据点没有显著差异（p＜0.05）。
渗透压值被用来评估和筛选最佳的降温速率、升温速率和冷冻保护剂的类型。
以NaCl为渗透压调整试剂，暴露于不等渗溶液后，细胞种群保留80%的膜完整性的渗透耐受极限被建立。
139~1075mOsm是80%小鼠ES细胞保留完整质膜的渗透压范围。1.0MCPA条件下ES细胞透压耐受极限与标准冻存方案（细胞培养基中含有50%的胎牛血清）相当。
提高iPSC的复苏率
在诱导多能干细胞冻/融过程中，细胞外渗透压可能发生突变。这种快速变化会导致细胞渗透休克，进而降低复融后的细胞存活率。ClínicaAlemana-UniversidaddelDesarrollo再生医学中心的科学家们使用下面的优化过程使细胞存活率增加了15%：
1
优化前工艺
将培养基倒入15mL的锥形管中，然后快速将冻存管中所有解冻的细胞加入培养基中
2
优化后的工艺
先将解冻的细胞放入15mL锥形管中，然后缓慢滴加培养基
3
优化前工艺
细胞所处环境的渗透压突然变化可能导致水快速透过细胞膜，这可能会对细胞造成压力，从而导致的细胞死亡。避免这种压力可以使细胞更好地生存
提高细胞复苏率：诱导多能干细胞的冻存和复苏优化。MarkusUhrig*,FernandoEzquerandMarceloEzquer*欧洲诱导多能干细胞库(EBiSC)。