科研立新，卓越精进——艾仁德艾柱燃烧产物保护视网膜损伤的机制
2021年5月21日，以浙江艾仁德及乾一生物科技有限公司艾柱为药物与试剂的实验报告《艾柱挥发油和燃烧产物成分GC-MS分析及抗氧化活性比较》在国家一类期刊《中成药》杂志网络首发。
《中成药》是中医药科研领域内的一份专业性期刊。面向中药成药生产企业人员和质探人员，同时也向医学工作者提供中药的研究动态和发展趋势。
该报告通过筛选得到16种活性成分、619个潜在靶点、524个RD疾病靶点、17个MSE-RD共同作用靶点。MSE治疗RD的靶点涉及CASP7、RORC、GBA、ATF6等，生物过程主要涉及衰老、对糖皮质激素的反应、对皮质类固醇的反应、去磷酸化、对维生素D的反应等;核心靶点涉及Th17细胞分化、IL-17信号通路、NF-κB信号通路等，核心蛋白为JUN、PTGS2;能显著降低JUN上游ERK1/2和p38MAPK磷酸化蛋白的表达。
报告研究结论：
1MSE活性成分共得到16种MSE活性成分(表1)和619个潜在作用靶点。
表1MSE活性成分Tab.1ActiveMSEcomponents
编号英文名中文名
MSE13-furanmethanol3-呋喃甲醇
MSE24-hydroxy-butanoicacid4-羟基丁酸
MSE32(5H)-furanone2(5H)-呋喃酮
MSE4phenol苯酚
MSE5amitrole3-氨基-1,2,4-三氮唑
MSE6D-limonene双戊烯
MSE7maltol麦芽酚
MSE8benzothiazole苯并噻唑
MSE9methenamine乌洛托品
MSE10caryophylleneoxide石竹素
MSE11salsoline叉明草素
MSE12dibutylphthalate邻苯二甲酸二丁酯
MSE13oleicacid油酸
MSE14(Z)-9-octadecenamide油酸酰胺
MSE15behenicalcohol1-二十二醇
MSE16stigmasterol豆甾醇
MSE活性成分及其靶点相互作用的网络图图1显示，方形阵列的为药物作用靶点，环状排列的为MSE的活性成分，每条边代表活性成分与靶点间的相互作用关系;MSE中麦芽酚、油酸、乌洛托品等主要成分连接的靶点较多，与CASP7、RORC、CASP3、GBA等潜在靶点相互作用密切。
RD靶点在OMIM数据库中以“Retinadamage”为关键词进行检索，将RD靶点合并，剔除重复项，最终得到524个。2.4MSE靶点与RD相互作用的网络图将619个MSE活性成分靶点基因与524个RD靶点基因取交集，得到17个MSE作用于RD的靶点。通过Cytocsape3.8.0软件构建MSE靶标与RD相互作用的网络，见图2，其中圆形(蓝色)代表疾病，正六边形(绿色)代表药物，正三角形(黄色)代表有效活性成分，倒三角形节点(红色)表示主要靶点，节点间相互作用关系用边表示。由此可知，MSE能通过多成分、多靶点联合调节的方式治疗RD。
PPI网络MSE与RD相关的靶点共17个，将其上传至STRING数据库，构建蛋白相互作用网络，见图3，其中节点表示蛋白，边表示功能相关性，共包括17个节点、36条边，平均节点数为4.24，平均局部聚类系数为0.732。通过基因相互连接次数选取Degree值较高的为核心基因，前5位分别为前列腺素G/H合成酶2(ProstaglandinG/Hsynthase2,PTGS2)、转录因子AP-1(TranscriptionfactorAP-1,JUN)、溶酶体酸性葡萄糖神经酰胺酶(Lysosomalacidglucosylceramidase,GBA)、酪氨酸受体激酶(Tyrosine-proteinkinaseLck,LCK)、碱性磷酸酶组织非特异性同工酶(Alkalinephosphatase,tissue-nonspecificisozyme,ALPL)，同时它们也是调节视网膜结构与功能的关键因子。
GO富集分析将17个MSE与RD相关的靶点导入Metascape数据库进行GO功能分析,共得到P<0.01的286个富集结果，其中生物过程(Biologicalprocess,BP)240项，主要涉及衰老、对糖皮质激素的反应、对皮质类固醇的反应、去磷酸化、对维生素D的反应等;细胞组成(CellularComponent,CC)9项，主要涉及转录因子AP-1复合体、核被膜、核纤层蛋白丝、细胞外面上细胞器、RNA聚合酶II转录因子复合体等;分子功能(MolecularFunction,MF)37项，主要涉及cAMP反应元件结合、DNA结合转录激活物活性，核受体的激活、转录因子活性，直接配体调控序列特异性DNA结合、磷酸酶激活等。根据-LogP值进行排序，分别在生物过程、分子功能、细胞组分中选出排名靠前的条目
KEGG富集分析利用Metascape数据库进行KEGG富集分析，设置P<0.05，筛选出与MSE保护RD相关的信号通路，结果见图5，可知核心靶点JUN主要富集到Th17细胞分化信号通路(图6)。再根据P值进行排序，前20条KEGG通路及其相关信息
KEGG富集分析Fig.5KEGGenrichmentanalysis
Th17细胞分化富集分析Fig.6EnrichmentanalysisforTh17celldifferentiation
近年来随着各类电子设备的普及，视网膜损伤(RD)的发病率日益增高，表现为眼部酸胀、疼痛、视物模糊、眼睛干涩等眼部疾病，中医称其为“肝劳”[9]。艾灸在治疗RD方面表现出良好的受众基础和临床疗效。为了阐释艾柱燃烧产物(MSE)活性成分对RD的保护作用，本研究通过网络药理学、分子对接、体外细胞实验相结合的研究方法，对其可能的作用机制进行了综合分析。通过综合分析MSE活性成分靶点网络和分子对接，发现MSE关键化合物主要为油酸、麦芽酚和乌洛托品等。其中，油酸是一种单不饱和脂肪酸，能预防由高脂血症引起的RD[10];麦芽酚是一种天然的芳香化合物，具有较强的自由基清除能力，能抑制H2O2作用下NF-κB核转录因子的磷酸化，从而保护RGCs细胞免受氧化应激的损伤[11];乌洛托品作为一种具有抗生素活性的杂环有机化合物，可能在艾灸过程中起到一定的消毒杀菌作用[12]。蛋白互作网络PPI显示，MSE保护RD的靶点涉及CASP7、RORC、GBA、ATF6等。其中，Caspase-7(CASP7)是哺乳动物细胞caspase家族中参与细胞凋亡执行的成员，在损伤诱导的RGC细胞的死亡中发挥关键作用，抑制其活性是青光眼和其他视网膜神经退行性疾病的新治疗策略[13];RORC(维甲酸相关孤儿核受体)是一种重要的T细胞转录调控因子，它在实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(EAU)的进程中会发生动态甲基化改变，通过调控这种动态的甲基化过程可对其进行治疗[14];GBA是一种与帕金森疾病密切相关的基因，帕金森病患者视觉障碍与其的突变有关[15];激活转录因子6(activatingtranscriptionfactor6,ATF6)是6种会导致全色盲(Achromatopsia,ACHM)的基因之一，其突变或者多组等位基因的删除会引发视力下降，甚至全色盲，外源性激活药物可能通过促进ATF6从内质网到高尔基体的转运来帮助其恢复活性，进而纠正视力损伤[16]。通过Metascape数据库进行KEGG信号通路富集分析，发现MSE治疗RD的关键通路涉及Th17细胞分化、IL-17信号通路、NF-κB信号通路等。其中，Th17细胞是一种以表达转录因子RORC为特征的淋巴细胞亚群，在自身免疫性疾病的发生机制中发挥重要作用[17]，体外的小分子化合物能通过调节其免疫应答来诱导Treg细胞改善实验性EAU[18];IL-17RA作为IL-17信号通路的主要受体，当视网膜色素上皮细胞(RPE)处于氧化应激(OS)状态时抑制其蛋白表达后，可预防OS诱导的RPE细胞凋亡和炎症反应[19];NF-κB是一种快速诱导的转录因子，在基因诱导的疾病细胞反应中发挥着广泛作用，尤其是在免疫系统中[20]，ROS介导其激活后，可直接调控Ascl1表达和成纤维细胞重编程为化学诱导的光感受器样细胞(chemicallyinducedphotoreceptor-likecells,CiPCs)，在视网膜变性小鼠模型中金额部分恢复瞳孔反射和视觉功能[21]。采用分子对接技术将MSE活性成分与关键靶点JUN上游ERK1/2、p38MAPK蛋白进行结合能力预测，发现麦芽酚、石竹素、叉明草素、豆甾醇与2种蛋白均具有良好的结合活性。同时，结合蓝光诱导ARPE-19细胞损伤模型对具有结合活性的ERK1/2、p38MAPK靶点进行验证，发现MSE组两者蛋白表达显著降低，表明MSE能通过作用于JUN上游ERK1/2、p38MAPK信号通路来拮抗RD发生发展。此外，本研究基于前期实验结果发现，虽然艾柱在燃烧后成分组成发生了很大变化，但其作用于RD疾病的靶点却与艾柱挥发油基本相同，表明通过网络药理学来研究中药在燃烧或炮制过程中化学成分的变化及作用靶点的改变是有价值的，可更明确是哪些活性物质及靶点在疾病治疗过程中起到核心作用。
传承古法，科研立新，浙江艾仁德及乾一生物科技有限公司从2019年启动《亮眼艾柱中主要功效成分分析及基于细胞模型的亮眼灸改善视力机制研究》科研立项，到目前实验报告《艾柱挥发油和燃烧产物成分GC-MS分析及抗氧化活性比较》，标志着浙江艾仁德及乾一生物科技有限公司“科学制艾”项目进入到更高水平领域，也呈现了公司“用心制好每一支艾”的卓越追求。
不忘本心继续精进
浙江艾仁德及乾一生物科技有限公司继承与发扬中国传统中医养生文化精髓，弘扬中国古代艾灸养生文化，在积极吸收古法精髓艾灸技艺的基础上，结合现代用户需求创新手法，更新产品升级。加大艾灸文化传承力度，让更多人了解与认识艾灸技能，为打造健康中国梦贡献一份力量。
浙江艾仁德及乾一生物科技有限公司为推动艾灸全产业链的可持续化发展，进而满足消费者对健康服务、养生服务的多元化需求。以及在大健康产业和健康中国战略的带动下、行业热烈呼声与期待下，艾仁德新厂于2020年3月开始全面运营。
艾仁德充分利用巨大的艾灸市场优势，整合资源，精心组织各项科研活动，以高规格、高标准、高实效为起点，贴近市场、服务用户，加强创新与合作，为客户开发市场搭建专业化品牌推广平台。
浙江艾仁德及乾一生物科技有限公司紧跟时代需求，专注眼部养护领域，开拓进取，始终秉承“匠心制艾，弘灸之道”精神，弘扬中国艾灸文化，让民族品牌走向世界。
(来源：温州视线)