CRISPR干预的CHO细胞系开发方法

由于整合位点不可控,RI造成的两个主要缺点包括由于转基因插入的异质拷贝数和位置导致的高克隆变异,以及由于转基因拷贝数的丢失、染色体重排和表观遗传调控导致的生产时间克隆稳定性的降低。因此,将转基因敲入(KI)到转录活跃的基因组热点的靶向整合(TI)方法已成为一种可控和可预测的CLD方法。将转基因精确插入所谓的基因...

国自然撰写:经典分子机制研究(一)|位点|质粒|扩增|dna|rna|聚合酶...

因在基因B启动子扩增的引物的两端插入了NheI和HindIII酶切位点,故用NheI和HindIII限制性酶酶切后与pGL3-promoter载体上的NheI和HindIII粘性末端位点相连。2.1.3构建pGL3-Basic-基因BP(-1761/+37)质粒P(promoter)将酶切的PCR产物连入pGL3-Basic质粒,经转化细...

「星耀小课堂」一文读懂|IVT RNA质粒模板序列设计全解析

抗性基因对于阳性克隆的筛选和质粒的维持至关重要。质粒转化为大肠杆菌是一个低效的过程，因此需加以抗性基因等选择性标记筛选含有目标质粒的重组菌落。此外，从细菌生长的角度来看，质粒的存在可能是不利的，因而会导致一定程度的质粒丢失，而添加抗生素能够维持质粒的存在。《中华人民共和国药典》明确要求，除另有规定外...

人偏肺病毒融合蛋白疫苗:研究进展

位点Ⅱ:位于位点Ⅲ和Ⅰ之间,是单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)M1D2和M1C7的靶标,该表位在hMPVPreF和PostF构象中保守,故该位点特异性的McAb均可以与PreF和PostF结合。hMPVF蛋白Ⅳ位点:与RSVF蛋白相似,是交叉中和抗体和Ⅳ位点结合抗体101F、54G10和17E10的靶点;McAbMPV481具有hMPVF蛋白特异性,...

堪称分子生物学界的「瑞士军刀」,这款工具分分钟带你成为大佬

用SnapGene打开表达载体pET28a的质粒图谱。根据实验将使用的无缝克隆试剂以及技术选择相应的选项,以In-Fusion为例。依次在工具栏中点击:Actions-In-FusionCloning-InsertFragment(这里以插入一个片段为例)。光标放在载体的MCS(多克隆位点)处,选择页面最下面一排的「Sequence」显示核苷酸序列以方便拖选(要...

干货| 酶切实验切开 or 切不开,真的是玄学吗?

DNA限制性内切酶酶切是一项基于DNA限制性内切酶的基因工程技术,限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA(www.e993.com)2024年11月19日。分子克隆是玄学,酶切成功靠运气?今天我们就来分享一下酶切经验和绝招,解决切不开、错切难题,get实验成功关键点,打破酶切玄学!

2024合成生物学竞赛常规赛队伍专题之Antibiotic-free团队丨无抗...

一个合格的质粒通常由复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等元件组成。其中质粒载体上的抗生素抗性基因,例如:氨苄西林(Ampicillin)、卡那霉素(Kanamycin)抗性基因,可以筛选成功导入质粒的细菌,没有质粒DNA的细菌无法在含有抗生素的培养平板中存活,从而使目的菌株脱颖而出。

啥是质粒?从生物武器到转基因食物都跟它有关

在保留天然质粒优势的基础上,人工改造的质粒增加了抗性标记,人们可以根据需求筛选不同的菌株。同时,质粒上还可以设计多克隆位点,利用相关的酶将质粒分子打开,接入外源DNA,利用质粒自我独立复制的特性,将外源DNA的信息传递给宿主细菌,从而实现性状的改造。构建重组质粒的步骤:1.获取含有质粒的菌株;2.提取质粒并用...

分子克隆技术全攻略

关于载体一般常用到的是质粒载体,它是一种小型环状DNA分子—在基因工程中作为最常用,最简单的载体。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作...

摆脱PAM限制,Cas9突变体SpRY带来分子克隆新变革?

分子克隆是众多实验室最基本也是最重要的实验技术,目前这一领域中最常用的是限制性内切酶系统。限制性内切酶须识别并结合特定的核苷酸序列方能发挥其酶切功能。现有内切酶可识别的核苷酸序列有限,极大的限制了分子克隆实验的灵活性。与限制性内切酶相比,CRISPR-Cas系统对靶位点的识别和酶切并不局限于特定的核苷酸序列,但...