师弟一举赢得 qPCR 「最美」曲线,暗藏哪些小心机?

1.熔解曲线出现杂峰:1)杂峰在主峰之前,说明存在引物二聚体,建议需要重新设计引物。2)杂峰在主峰之后,大多由非特异性扩增引起,建议调整稀释倍数、减少引物。2.扩增曲线抖动,不光滑或没有平台期可能因为仪器不准或模板不纯。建议进行仪器校准;增大模板稀释倍数。3.实验重复性差1)样本问题:每次实验尽量...

大规模新冠核酸筛查中出现的异常扩增曲线分析

建议采用质量好、加热不易变形的封板膜;核酸加样后用力压实封好反应板,上机扩增前再次检查有无缝隙。05内标离散型内标离散扩增曲线:正常内标扩增曲线:内标离散扩增曲线:正常内标扩增曲线:01曲线特点:内标扩增曲线呈现开花散开式,扩增曲线不集中,各孔高低异常不平,呈离散型分布。02原因分析:本次气模...

小曲线大学问-新冠核酸异常扩增曲线知多少?

曲线特点:所有通道的扩增曲线出现锯齿状。原因分析:扩增仪电压不稳、采光或者滤光片故障。解决方案:检查扩增仪电压和光路系统,及时排除硬件故障,防止后续检测的异常结果。若扩增仪故障严重影响扩增曲线判读时应重新检测。总结新冠核酸检测过程中每一个环节的操作都有可能产生异常扩增曲线,干扰结果判读。检测人员在上...

如何解析新冠核酸检测中的异常扩增曲线?

(2)复检样本,如果复检后曲线为阴性直线则说明之前的末尾起跳为非特异性扩增,如果复检后曲线与之前一末尾起跳表示该样本中待检病毒核酸的浓度偏低。(3)更换试剂,建议使用不同厂家试剂比对。(4)对操作环境进行处理,或更换新的环境、加样器、枪头以及所有的引物、试剂等。4.扩增曲线分布混乱原因分析:荧光波长...

PCR异常扩增曲线原因及案例分析

常见异常曲线原因1确认软件设置是否正确对照试剂盒说明书,检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是,需要看下所选用的试剂中是否含有ROX来作为参比荧光染料。2确定耗材及仪器配件是否使用正确耗材对于荧光定量PCR来说比较重要,很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的...

新冠内标扩增反应曲线呈锯齿状,原因是……

1.原提取板模板+重新提取板模板复检:对2011号及2018号标本重新进行了核酸提取,并用原提取板模板与新提取板模板同时进行复检,结果如图4所示(www.e993.com)2024年11月4日。结果显示2011号及2018号标本无论是原板还是重新提取板的模板内标均有扩增曲线,核酸检测结果为阴性。图4原板与重提取模板PCR扩增反应曲线...

收藏!PCR异常扩增曲线分析攻略

图八:未将托架上半部分取下,造成有些靶标未扩增3确定所用试剂是否正常如果设置都正确,耗材及配件也都没问题,但是扩增曲线还是异常,这时候要确定下所用试剂是否正常。首先要确定试剂是否有效,包括查看试剂是否在有效期内,是否反复冻融多次,运输条件是否正常。可以通过比较试剂的批次号,结合实验中的阳性对照结果,...

专家共识发布,核酸检测技术全面解读!

无需标准曲线和标准品,可有效降低临床样本复杂本底对扩增的干扰,具有良好的重现性和准确度。其主要影响因素是PCR扩增和荧光信号分析,前者与PCR扩增效率、扩增体系的配置有关;后者与检测器的灵敏度、核酸拷贝数、被分割成的物理单元数以及反应单元数有关,反应单元数越多,灵敏度越高。

“超神”级经验分享!知道这6方面,做新冠核酸检测的“焦虑”少一半

接触性污染通常有点规律,例如试剂分装前试剂被污染,那么绝大部分孔均会阳性起跳,扩增曲线较为一致,现象类似于气溶胶污染。如果是手套有污染物,则可能在解除扩增管盖子时污染盖子,污染多发生在管盖上手套接触过的部位,一般是在八连管的两端出现污染较多。如果移液枪有污染,则其阳性孔分散度较高些。

干货| CT值大原因速查,qPCR 实验优化三步走

非特异性扩增消耗引物和Taq酶,会降低引物与目标基因结合概率,从而影响扩增效率。优化方式引物符合引物设计原则,避免出现非特异性扩增,注意引物扩增效率需在90%-110%之间;引物扩增效率的计算将基因扩增产物进行梯度稀释(至少三个梯度)同时进行qPCR,得到的CT值仪器会自动拟合标准曲线,或将CT值导入Excel中...