植物中验证蛋白相互作用的Pull-down和Co-IP详细技术方案

??Co-IP:商业化琼脂糖凝胶交联的标签抗体珠子(agarose-conjugatedanti-TAGbeads,MBIFermentas)、抗生素和LB(Luria-Bertani)液体培养基,苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂(Cocktail)为Pull-down与Co-IP共用。3试剂配方Pull-down(表1)和Co-IP(表2)所用的试剂配方如下。4仪器设备超声...

实验技巧精要 | 如何轻松获得高质量 western blot 条带图?

2.抑制蛋白降解这是样品制备中最需要注意的部分。抑制样品蛋白降解的方法主要有两种:(1)使用蛋白酶抑制剂小编使用的是罗氏公司(Roche)的蛋白酶抑制剂Cocktail片剂,效果不错。再与PMSF共同使用,可以很好地抑制蛋白降解。(2)全程低温操作提前预冷PBS、裂解液甚至枪头等,从收集细胞开始一直到煮样的...

艾美捷-WB常见问题-50问【上】

做WesternBlot时,提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个santacloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查WesternBlot...

做WB 你最容易忽略的几个细节,我们找出来了

使用裂解液裂解时,需提前加入蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂,以抑制内源性蛋白酶对细胞蛋白的降解和磷酸酶的去磷酸化作用。阅读裂解液说明书,来明确是否需要额外添加蛋白酶抑制剂(PMSF#8553或ProteaseInhibitorCocktail#5871)或者磷酸酶抑制剂(PhosphataseInhibitorCocktail#5870)。对于CellLysisBuffer(#9803...

环状RNA研究之PAR-CLIP

▲12.2×蛋白酶K缓冲液:100mMTris-HCl(pH7.5),150mMNaCl,12.5mMEDTA,2%(w/v)SDS▲13.5×NP40裂解液、IP洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液等在实验前直接加入0.5mMDTT和无EDTA的蛋白酶抑制剂cocktail(Roche)后使用。