大肠杆菌DH5α感受态制备(CaCl2法)

感受态是指受体细胞易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。感受态由受体细胞的遗传性状所决定的,受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可提高感受态水平一万倍,而Ca2+存在也可大大促进转化的作用。新鲜,幼嫩的细胞是选择做感受态细胞很好的材料。带有外源DNA的重组质粒,在体外构建后,导入宿主细胞,随着细胞的大...

CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和实验步骤

受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株,不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R-,M-),可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法,如电击或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂的处理后,细胞膜的通透性增高,成为感受态细胞(Compenentcells),使外源DNA分子得以进入。目前常用的感受态细胞...

当心!转化实验不注意这几点,课题就要中断|细胞|细菌|dna|菌株|...

由于化学感受态细胞是通过阳离子和热激处理使其细胞膜穿透性增强,所以对于某些具有细胞壁的菌株,化学转化则不太适合。电转的转化效率更高。因此电转可用于不同浓度(从低浓度到饱和浓度)、不同大小、不同复杂度DNA的转化。那些不能制成化学感受态的菌株可以制成电转感受态。但进行电转需要额外的设备,如电转仪...

体外法研究酵母发酵饲料对瘤胃发酵参数及瘤胃细菌数量的影响

目标菌的PCR产物纯化后与TaKaRa公司的pMD-19T载体连接,转化至感受态细胞DH5α,进行克隆培养,蓝白斑筛选,随机挑选白斑菌落,接种于含4.2μLAmp(100μg/mL)的3mLLB液体培养基中,37℃振荡培养过夜;委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序,将测序结果在GenBank上使用Blast进行比对;同时用天根生化...

质粒构建 | 从入门到精通|扩增|dna|pcr|克隆_网易订阅

常见的感受态细胞非TOP10、DH5α、BL21莫属了,他们可是转运过程的小能手,负责质粒的克隆和表达。转化及鉴定简要步骤将连接产物加入感受态细胞,冰上放置30min、42°C热激转化或电转化,加入无抗性LB培养基,200rpm-37°C摇床摇45-60min后,涂至抗性或者其他筛选平板上,37°C培养过夜、挑取3-5...