Nature重磅综述 |关于RNA-seq,你想知道的都在这

尤其是在使用单端测序(single-endsequencing)时更是如此,因为一对片段只要一端序列相同就会被认为是一个重复(duplicate);而双端测序(paired-endsequencing)中,片段化的两端必须发生在同样位置才会导致duplicate,而这个的发生概率比较低。但是,在制备cDNA文库时,由于PCR的偏好性,还是会引入duplicationreads;很难...

走进PCR小世界,常见问题知多少

2、假阴性,不出现扩增条带一、模板核酸的制备:模板中含有杂蛋白质、Taq酶抑制剂;在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚;模板核酸提取过程出现问题。二、酶的质量及活性:酶失活需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。三、引物的质量与特异性:引物质量、引物的浓度、两...

信得科技检测团队在中科院Top期刊《Poultry Science》上发表最新...

CycleaveqPCR反应体系为25μL,包括12.5μL的CycleavePCRMix(2×Conc.),上游引物(10μM)和下游引物(10μM)各0.5μL,ts-11探针(5μM)和非ts-11探针(5μM)各1μL,模板2μL,灭菌水7.5μL。反应条件为95℃预变性30s;95℃变性10s,60℃退火30s,72℃延伸20s,共40个循环。延伸时进行荧...

知识分享|一文了解实时荧光定量PCR(qPCR)技术的原理与分类

1.反应阶段实时荧光定量PCR的整个反应过程可分为基线期、指数期和平台期3个阶段:基线期:PCR反应刚开始,受背景信号的影响,荧光信号无明显变化,无法判断产物量的变化;指数期:随着循环数不断增加,PCR产物量的指数与DNA模板数呈线性关系;平台期:随着DNA聚合酶、dNTP和引物探针消耗殆尽,扩增信号达到稳定,不再增加,...

学术大爆发!中国/华人学者一天发表35篇Nature Communications|...

8清华大学孙前文团队在NatureCommunications在线发表题为“PrimasepromotesthecompetitionbetweentranscriptionandreplicationonthesametemplatestrandresultinginDNAdamage”的研究论文,该研究发现引物酶促进同一模板链上转录和复制之间的竞争,导致DNA损伤。

PCR反应的几大要素(各组分和条件)

4.引物:PCR引物是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸(www.e993.com)2024年11月18日。能够与模板DNA中目标区域的侧翼序列结合(通过序列互补)。在PCR反应期间,DNA聚合酶从3′端开始延伸引物。因此,引物结合位点必须是靶标附近所特有的,并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性,以确保目的片段的特异性扩增。

PCR 引物设计图文详解,一看就会

7、引物自身及引物之间不应存在互补序列引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成...

【专家共识】ctDNA高通量测序临床实践专家共识|高通量测序|ctDNA|...

分析中阶段包括“湿实验”和“干实验”两个步骤,“湿实验”包括核酸提取、引物或探针设计合成、文库制备、上机测序等步骤,其中文库制备可选择杂交捕获或扩增子建库,该阶段的质控应对核酸提取中的核酸浓度、纯度和片段分布做出相应要求并遵照执行;“干实验”涵盖生物信息学分析流程各步骤,该阶段质控应对最低测序深度、...

RT-PCR知多少,有这一篇就够了

1.上下游引物要保守:扩增子长度需选择一段保守片段(100-200bp)进行PCR扩增,选择片段需跨越内含子,因内含子的基因组DNA序列不会被扩增,也可减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性风险。引物选取同样需要保守。2.引物长度和Tm值:引物设计长度为18-25bp,Tm值在50-65℃之间,引物中GC含量在40-60%。设计...

干货分享:荧光PCR法检测基因突变之反应体系优化

变性后温度快速降至退火温度可使引物与模板结合,由于模板DNA比引物复杂,引物与模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。在Tm值允许范围内,选择较高的退火温度可减少引物与模板之间的非特异结合及引物二聚体形成,提高PCR扩增特异性。目前常见地,荧光PCR退火温度一般设定为60℃,也可以通过逐步提高或降低退火...